Microbiologia Agrícola

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    Caracterização e otimização da produção do bacteriófago lítico vB_EcoM_UFV09
    (Universidade Federal de Viçosa, 2019-02-26) Silva, Jéssica Duarte da; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/0374413607226322
    Bacteriófagos, ou fagos, são vírus que infectam bactérias. Logo após serem descritos, esses organismos já eram usados no tratamento contra bactérias patogênicas, o que chamamos de fagoterapia. Porém, com a descoberta da penicilina no final dos anos 30, a utilização dos bacteriófagos na clínica médica foi perdendo a força até ser praticamente esquecido. O recente aumento de cepas bacterianas resistentes à antibióticos fez com que a fagoterapia voltasse a surgir como alternativa no tratamento de doenças bacterianas. Outra importante aplicação dos bacteriófagos é contra os biofilmes bacterianos. Dentre as enzimas fágicas com importante potencial contra os biofilmes estão as hidrolases do tipo depolimerases, e as lisinas. Sendo assim, o estudo envolvendo bacteriófagos ultrapassa a aplicação médica e começa a ser considerado para contextos mais amplos, em escala ambiental. Uma das principais limitações do uso de bacteriófagos em sistemas ambientais é a quantidade exponencialmente maior de partículas virais do que se é produzido normalmente em laboratório. Estudos e metodologias que visam otimizar e tornar economicamente viável a produção de bacteriófagos em larga escala são de extrema importância e representam uma demanda crescente. Este trabalho teve como objetivo caracterizar de forma morfológica e genômica o fago vB_EcoM_UFV09, que foi isolado a partir de amostras de esgoto, utilizando-se uma estirpe de bactéria Escherichia coli como hospedeira e analisar seu potencial na fagoterapia. Além disso, foi avaliado o impacto dos parâmetros de cultivo: temperatura, tempo de incubação, agitação e Multiplicity of Infection (MOI), na produção viral, comparando-se os resultados obtidos em meio mínimo M9 suplementado com seis fontes de carbono diferentes (acetato, ácido lático, piruvato, glicerol, succinato e glicose) e em meio rico Luria Bertani (LB). Nossos resultados demonstraram que o isolado pertence à família Myoviridae, mais especificamente ao gênero T4. A ausência de genes de patogenicidade e de resistência à antibióticos no genoma do vB_EcoM_UFV09, assim como a lise obrigatória da célula bacteriana após a infecção viral, são características promissoras para a utilização desse fago no controle do crescimento de estirpes da bactéria Escherichia coli. Além disso, a avaliação do impacto das variáveis de cultivo na produção da progênie viral demonstrou que fontes de carbono como succinato, glicose e LB proporcionam condições fisiológicas mais estáveis para a produção fago vB_EcoM_UFV09 em larga escala.
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    Caracterização genômica de profagos e de bactérias do gênero Desulfovibrio
    (Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-16) Crispim, Josicelli Souza; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/5230945928388455
    Bactérias do gênero Desulfovibrio pertencem ao grupo de Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS). As BRS causam significativos prejuízos à indústria de petróleo, principalmente devido à capacidade de causar corrosão microbiologicamente induzida, formação de biofilme e produção de H2S. Bacteriófagos são uma forma alternativa para o controle biológico das BRS, cuja informação para este grupo de bactérias, entretanto, é escassa. Assim, este trabalho teve como objetivos: 1) identificar e caracterizar profagos em genomas de Desulfovibrio; 2) verificar a expressão de profagos de Desulfovibrio alaskensis; 3) Isolar, sequenciar e montar genomas de BRS. Para identificação de profagos de Desulfovibrio foram utilizados 46 genomas depositados em banco de dados. 53 profagos completos foram identificados em 46 dos genomas analisados. Estes foram classificados dentro da ordem Caudovirales, com 69,82% pertencentes à família Myoviridae. 18 profagos identificados possuem genes que codificam para lisozima e holina. Quatro dos genomas analisados apresentam profagos com identidade acima de 50% na mesma linhagem, cuja análise comparativa demonstrou a existência de colinearidade entre as sequências. Dos 17 genomas bacterianos fechados analisados, 6 possuem sistema CRISPR-Cas classificado como inativo. A identificação da poli-lisogenia, a proximidade entre os profagos completos e a possível inatividade do CRISPR-Cas nos genomas fechados analisados, permitiu a escolha de linhagens poli-lisogênicas com profagos pertencentes à família Myoviridae para isolamento de profagos e testes em linhagens relacionadas para estudos posteriores. A linhagem D. alaskensis DSM16109 possui três profagos, cuja a expressão e a relação com vesículas de membrana externa foram verificados neste trabalho. A linhagem DSM16109 apresentou menor crescimento após a adição de mitomicina C em relação à cultura controle. Esta redução foi acompanhada da presença de partículas virus-like (VLPs), indicando indução de profagos por mitomicina C. Foi verificado o aumento do número de cópias dos genes cap dos três profagos e transcrição dos mesmos na amostra controle, entretanto, sem a formação de VLPs. Genes de profagos foram identificados em vesículas de membrana externa de culturas tratadas e não tratadas com mitomicina C. Os profagos de DSM16109 são induzidos de forma espontânea, mas, apenas a presença de mitomicina C levou à formação de VLPs. O material genético dos profagos detectado dentro de vesículas de membrana externa podem estar relacionados com a transferência horizontal de genes virais. Nas análises genômicas de isolados de amostras de plataformas de extração de petróleo da Bacia de Campos (RJ) foi verificado que a linhagem P37SLT pertence à espécie Desulfovibrio indonesiensis com 4,2Mb e a linhagem P48SEP pertence à espécie Desulfovibrio marinus com 5,1Mb. Ambas as linhagens foram sequenciadas pelo sistema HiSeq (2x300) e apresentam sequências relacionadas à profagos, uma característica comum do gênero Desulfovibrio encontrada nos genomas anteriormente analisados.
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    Isolation and characterization of lytic bacteriophages for the composition of a phage cocktail capable of reducing bacterial biofilms in oil-related environments
    (Universidade Federal de Viçosa, 2023-07-06) Silva, Jéssica Duarte da; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/0374413607226322
    Phages are viruses that infect bacteria and since their discovery in the early 20th century, they have been used to control bacterial growth. This work was divided into three chapters. The first genomically and biologically characterizes the Enterobacter phage vB_EclM-UFV01, presenting general characteristics of its genus, the Karamviruses. Chapter 2, examines the capacity of a phage cocktail (composed by enterobacteria-isolated phages) to reduce the biofilm of sulfate-reducing bacteria. The formulation of the cocktail, named Petro01, was performed by selecting phages from the collection of the Laboratory of Molecular Immunovirology at UFV and ended up being composed of three phages of the Tequatrovirus genus (briefly characterized genomically in this chapter) and one of the Karamvirus genus (described in Chapter 1). The stability of Petro01 under conditions similar to those found in petroleum-related environments, its shelf life at high storage temperatures, the supernatant composition (LB enriched with conservative compounds), as well as the propagation capacity of the phages that make up the cocktail in bench and a 12 L bioreactor, was also evaluated. Petro01 showed significant biotechnological potential and positive capacity for the composition of a phage-based product. Chapter 3 moves away from the environmental application of bacteriophages and characterizes, biologically and genomically, the Proteus mirabilis phages BigMira UFV01 and MidiMira UFV02, providing an overview of the common features of their genus, the Acadeviruses. It also presents the genomic evaluation of 10 strains of P. mirabilis, isolated in clinical environments, focusing on the LPS locus and the antimicrobial resistance profile. All phages described in this study have good potential as antibacterial agents. Keywords: Bacteriophages. Industrial microbiology. Sulfate-reducing bacteria. Bioproducing.
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    Uso do bacteriófago vB_EcoM-UFV13 como potencial agente antimastítico em vacas leiteiras
    (Universidade Federal de Viçosa, 2018-04-26) Duarte, Vinícius da Silva; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/7814802722636291
    A atividade leiteira no Brasil sofreu profundas transformações nos últimos anos no que diz respeito, principalmente, ao aumento da produtividade com um custo de produção cada vez menor. Para que tal resultado seja alcançado, o animal é invariavelmente desafiado a atender altos índices zootécnico. Dentro do manejo sanitário, a mastite bovina ainda é a principal causa de perdas econômicas para produtores de leite, estimado em $ 533 bilhões de dólares em todo o mundo. A Escherichia coli é responsável pela maioria dos casos de mastite ambiental (40%), enquanto que Trueperella pyogenes é um dos principais agentes causadores de mastite em novilhas no período seco. Embora a terapia com antimicrobianos convencionais seja a mais utilizada nos rebanhos, o uso de bacteriófagos como instrumento no controle de patógenos na Veterinária tem ganhado destaque. Neste trabalho, buscamos avaliar o uso do bacteriófago vB_EcoM-UFV13 (UFV13) contra estes dois importantes patógenos causadores de mastite bovina. Em um primeiro estudo, investigamos o uso do fago UFV13 na prevenção da formação do biofilme de T. pyogenes, um dos principais fatores de virulência apresentado por este micro-organismo. Empregando-se duas diferentes metodologias (cristal violeta e contagem de células sésseis), observou-se que somente a multiplicidade de infecção 10 apresentou redução, estatisticamente significativa, do biofilme formado. A análise das proteínas estruturais do vírus UFV13 revelou um repertório de proteínas com domínio hidrolase (Virion-Associated Peptidoglycan Hydrolases – VAPGHs) que potencialmente estão envolvidas no processo de adesão e desenvolvimento do biofilme. No segundo estudo, examinamos o fago UFV13 em termos genômico, a sua estabilidade em diferentes condições adversas, além da sua atividade contra E. coli em camundongos fêmeas lactantes. Estas análises revelaram que o vírus UFV13 é oriundo de uma recente infecção mista com Shigella phage Shfl2. Além disto, sua administração intramamária provocou uma redução de 10 vezes na carga bacteriana total, além de induzir a produção de citocinas pró-inflamatórias como IL-6 e TNF-α. Após esses estudos, a completa caracterização do fago UFV13 o torna um possível candidato para controle da mastite bovina no gado leiteiro.
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    Avaliação do efeito de um coquetel de bacteriófagos e uma peptideoglicano-hidrolase associada a virion sobre biofilme de bactérias redutoras de sulfato
    (Universidade Federal de Viçosa, 2021-07-12) Paes, Isabela da Silva; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/0820884110808352
    O biofilme consiste em um dos grandes associado a indústria de petrolífera, devido à dificuldade na remoção completa dos microrganismos inseridos na matriz. O biofilme formado por BRS é o responsável pelo aumento da concentração de metabólitos corrosivos no interior das instalações metálicas e diferentes abordagens são almejados para mitigar este problema. Os bacteriófagos e suas proteínas líticas, como peptideoglicano-hidrolases associadas a vírions (VAPGH), têm se mostrado uma alternativa para eliminação de microrganismos devido à sua especificidade. No primeiro capítulo deste trabalho foi avaliado o potencial de um coquetel, composto por seis bacteriófagos, na prevenção da formação e remoção do biofilme de culturas mistas de bactérias redutoras de sulfato, isoladas da indústria petrolífera. Foi observado que o coquetel de bacteriófagos proposto preveniu parcialmente a formação do biofilme pela cultura P55(água de injeção]) e P48SEP (separador de produção), e impediu a formação do mesmo para as culturas P48SEP, P55 e P37 (tangue Slop). Ademais, no segundo capítulo foi avaliada a atividade muralítica de uma putativa VAPGH, codificada pelo bacteriófago vB_EcoM-UFV13 e expressa de forma heteróloga, em um sistema procarioto, sobre a formação de biofilme por Escherichia coli. A VAPGH 246 foi expressa a partir da indução com 0,5 mM IPTG e purificada por cromatografia de afinidade. Foi observada a redução significativa do biofilme de E. coli após 24h de tratamento. A presença da enzima, mesmo em baixas concentrações, mostrou ser mais efetivo que o tratamento com o bacteriófago vB_EcoM-UFV13. Desse modo demonstrando o potencial biotecnológico da aplicação de coquetéis fágicos multiespecíficos, assim como potencial das VAPGHs na eliminação e prevenção da formação de biofilmes de diferentes microrganismos. Palavras-chave: Bacteriófagos. VAPGH. Biofilme. Bactérias Redutoras de Sulfato
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    Characterization of prophage-like elements in plant pathogenic Xanthomonas species
    (Universidade Federal de Viçosa, 2022-03-04) Ferreira, Nataly Figueiredo; Alfenas-Zerbini, Poliane; http://lattes.cnpq.br/0465447261980949
    Bacteriophages are viruses that infect prokaryotes that are present in diverse environments. Prophages are bacteriophages with genome into the host genome and have been considered part of bacteria mobilome. For instance, bacteriophages may encode proteins that increase bacteria toxicity and virulence, confer genetic variability, and facilitate horizontal gene transfer, improving bacterial fitness. The Xanthomonas genus harbors many phytopathogenic bacteria that impair many crops worldwide. However, there is a scarcity of studies that describes bacteriophage distribution and diversity within this genus. Given this, our study aims to identify and characterize the presence of prophage-like elements in three species belonging to the Xanthomonas genus: X. axonopodis, X. campestris and X. citri. We found prophage-like sequences in 98% of the analyzed genomes, whereby more than one prophage-like was detected within the same bacterial genome, event denominated as polilysogen. The prophages-like from Xanthomonas spp. belonged to four viral families (Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Inoviridae), three families belonging to the Caudovirales order and one belonging to the Tubulavirales order (Inoviridae). Furthermore, many prophages-like harbored genes of putative bacterial origin, indicating horizontal gene transfer between the virus and host, such as genes encoding virulence factors. Taken together, these results indicated that prophages-like are widespread in Xanthomonas spp., influencing the genome diversity and fitness of these bacteria. Keywords: Bacteriophage. PHASTER. Genome plasticity. Bacteria fitness.
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    Avaliação da atividade lítica dos bacteriófagos vB_TpyM_UFV13, vB_TpyP_UFV21 e vB_TpyM_UFV26 específicos para Trueperella pyogenes associada a problemas reprodutivos no puerpério
    (Universidade Federal de Viçosa, 2014-07-25) Duarte, Vinícius da Silva; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/7814802722636291
    A bovinocultura leiteira vem sofrendo por profundas transformações nos últimos anos no que diz respeito, principalmente, ao aumento da produtividade com um custo de produção cada vez menor. Em meio a todos os fatores que comprometem o êxito de um sistema de produção de leite, o estado reprodutivo dos animais ocupa um lugar de destaque. Problemas reprodutivos em uma fazenda levam a perdas econômicas devido ao aumento no intervalo entre partos, custos extras com o tratamento da enfermidade, aumento no descarte involuntário de animais e uma diminuição no potencial genético do rebanho. Neste cenário, as patologias infecciosas e inflamatórias uterinas do puerpério (período pós-parto) como metrite, endometrite clínica e endometrite subclínica são as mais comuns, sendo, geralmente, causadas por microorganismos de origem ambiental como Escherichia coli, Trueperella pyogenes, Fusobacterium necrophorum e Prevotella spp. A utilização de antibióticos e hormônios são os tratamentos mais utilizados no controle destas enfermidades, porém o uso indiscriminado de antibióticos nas últimas décadas proporcionou o aparecimento de bactérias resistentes a mais de uma classe de agentes antimicrobianos. Sendo assim, a fagoterapia surge como uma alternativa natural, não tóxica e economicamente viável para o controle destes microorganismos. Neste estudo, isolamos e caracterizamos três bacteriófagos (vB_TpyM-UFV13, vB_TpyP-UFV21 e vB_TpyM-26) que apresentaram perfil protéico e padrão de bandas (RAPD) diferentes, o que auxiliou na diferenciação viral, principalmente entre os membros da família Myoviridae. Estes fagos reduziram o número de células viáveis de T. pyogenes (variação de 9,7 a 17,4%). Além disso, foram capazes de prevenir a formação de biofilme, com valores de redução que oscilarem entre 42,5 a 63,1%. Este trabalho possui como perspectiva o sequenciamento de seus genomas, testes farmacocinéticos utilização destes vírus no controle de enfermidades que acometem vacas de leite como mastite e metrite.