Microbiologia Agrícola

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Assessment of metabolic regulation and stress response in oleaginous yeasts by systems biology approaches
(Universidade Federal de Viçosa, 2024-01-30) Almeida, Eduardo Luís Menezes de; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/3157480507007265
The current environmental crises promoted by the extensive use of oil have highlighted the necessity of alternative and sustainable production chains. Lipids and fatty acids from oleaginous yeasts produced from lignocellulosic hydrolysates are promising sources for oleochemicals. Hence, selecting and developing robust yeast strains that can grow and produce lipids in lignocellulosic hydrolysates is pivotal to broaden their applicability and viability. Lipomyces starkeyi is an oleaginous yeast capable of growing and producing lipids using a diverse range of carbon sources. Its growth and lipid production have been demonstrated in lignocellulosic biomasses. Papiliotrema laurentii can also assimilate sugars derived from agricultural wastes, such as glucose and xylose from lignocellulosic biomasses, and convert them into high lipid amounts. However, wild P. laurentii strains are highly sensitive to acetic acid, one of the primary inhibitors in lignocellulosic hydrolysates. The understanding of multifactorial stress responses and yeast physiology can be facilitated by the application of holistic approaches, including biological networks and high-throughput data. Therefore, we hypothesized that the use of systems biology approaches, including genome-scale metabolic models (GEMs) and transcriptomics, as well as their integration, can support us to understand the metabolism and stress responses of oleaginous yeasts and identify suitable targets for metabolic engineering. Herein, we propose the first GEM of L. starkeyi, lista-GEM. We reconstructed lista-GEM using two high-quality oleaginous yeast models as templates and curated it to reflect the metabolism of L. starkeyi. The simulated phenotypes and predicted flux distributions were in good accordance with experimental data. Then, we predicted targets to improve lipid production in glucose, xylose, and glycerol. Enzymes related to lipid synthesis in the endoplasmic reticulum, such as stearoyl-CoA desaturase, fatty-acyl-CoA synthase, diacylglycerol acyltransferase, and glycerol-3-phosphate acyltransferase, were the main targets to improve lipid production. Glycolytic genes were also predicted as targets for overexpression. Pyruvate decarboxylase, acetaldehyde dehydrogenase, acetyl-CoA synthetase, adenylate kinase, inorganic diphosphatase, and triose-phosphate isomerase were predicted only when glycerol was the carbon source. Hence, lista-GEM provides multiple metabolic engineeringtargets to improve lipid production by L. starkeyi using carbon sources from agricultural and industrial wastes. Furthermore, we combined transcriptome and genome-scale metabolic modeling to deepen our understanding regarding the targets of acetic acid stress, as well as the adaptive responses in P. laurentii. Acetic acid stress promoted global expression changes and most repressed genes were related to transcriptional and translational processes. Under stress, the sensitive strain induced DNA mismatch repair mechanisms and meiosis, while the tolerant strain negatively regulated autophagy and the cell cycle. The tolerant strain induced processes responsible for increasing the intracellular pH (e.g., arginase, ornithine metabolism, urea cycle), detoxification of toxic compounds (e.g., glutathione metabolism), and proton efflux. The tolerant strain also presented a remarkable NAD(P)H pool in the metabolic modeling analysis, which might support the reducing power required by tolerance mechanisms. Otherwise, the sensitive strain induced genes related to cell wall biogenesis and cobalamin synthesis. Overall, the genes and pathways described herein as tolerant-related can be useful in future metabolic engineering strategies to improve the tolerance of P. laurentii to weak acids, boosting its application in lignocellulosic-based biorefineries. Keywords: Metabolic modeling; Transcriptomics; Non-Saccharomyces.
Botryosphaeriales endofíticos e fitopatogênicos causadores de podridões pós-colheita em frutos de goiabas
(Universidade Federal de Viçosa, 2015-02-23) Abreu, Vanessa Pereira de; Pereira, Olinto Liparini; http://lattes.cnpq.br/1348590876266814
A goiabeira (Psidium guajava) é uma cultura de grande importância, destacando-se como uma atividade econômica e social de grande expressão. Nativa da América Tropical, a goiabeira, é amplamente cultivada em todas as regiões do Brasil. A produção da goiabeira tem sido limitada por vários fatores, dentre eles, destacam-se as doenças, com especial ênfase às que ocorrem em pós-colheita. A pinta-preta da goiaba é a doença pós-colheita de maior incidência. As goiabas acometidas pela doença apresentam sintomas que constituem-se, inicialmente, de pontos deprimidos, os quais evoluem rapidamente na superfície dos frutos, de forma concêntrica e tornam-se lesões de coloração escura com diversos pontos negros correspondendo aos sinais do patógeno. Vários trabalhos associam a pinta-preta da goiaba ao fungo Phyllosticta psidiicola entretanto, ainda não existem trabalhos mais abrangentes com estudos taxonômicos mais apurados que investiguem qual o real agente etiológico dessa doença. Além da pinta-preta da goiaba, existem outras doenças de pós-colheita muito comuns causadas por fungos da ordem Botryosphaeriales como a podridão parda associada ao fungo Dothiorella dominicana e a podridão de Lasiodiplodia associada à Lasiodiplodia theobromae. Entretanto, também existe uma carência de estudos mais abrangentes associados a essas doenças. Nos últimos anos novas espécies têm sido propostas a partir de estudos moleculares, evidenciando a existência de um complexo de espécies. Assim, os objetivos deste trabalho foram estudar a etiologia da pinta-preta da goiaba baseada na combinação de características morfológicas e moleculares, verificar o relacionamento das espécies causadoras dessa doença com as espécies endofíticas, estabelecer o posicionamento filogenético das espécies encontradas, bem como comprovar a patogenicidade das espécies associadas. Foram realizadas coletas de goiabas com sintomas de podridões pós- colheita, frutos secos e mumificados nos mercados do município de Viçosa – Minas Gerais e em uma área de cultivo no município de Piraúba – Minas Gerais. Folhas, ramos e frutos sadios foram coletados nesta mesma área, a fim de obter os isolados endofíticos correspondentes a área com elevada ocorrência da doença na pós- colheita. Isolados monospóricos foram obtidos e armazenados. Estes tiveram o DNA extraído e a região TEF1-α amplificada e sequenciada. A partir dos resultados das análises filogenéticas, um isolado representativo de cada espécie foi selecionado para a caracterização morfológica e testes de patogenicidade. Seis espécies de Botryosphaeriales foram identificadas, entre elas, três pertencentes ao gênero Neofusicoccum, uma pertencente ao gênero Phyllosticta e duas espécies de Lasiodiplodia. Entre estas espécies, duas serão propostas como novas (Neofusicoccum sp. e Lasiodiplodia sp.). Todas as espécies foram comparadas morfológica e filogeneticamente, com exceção de Lasiodiplodia sp. que não esporulou em meio de cultura. Todas as espécies tiveram patogenicidade comprovada. Os resultados deste trabalho serão fundamentais para futuros estudos envolvendo medidas de manejo da doença, programas de quarentena e especialmente, para o desenvolvimento de variedades de goiabas resistentes à pinta- preta e outras podridões de frutos.
Identification and gene expression analysis of genes encoding lactose permease and β- galactosidase in the Basidiomycota yeast Papiliotrema laurentii
(Universidade Federal de Viçosa, 2024-02-22) Assis, João Victor Marques Gonçalves; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/3711225610372587
Ricotta whey, an effluent generated by the dairy industry during the ricotta cheese manufacturing, is rich in the disaccharide lactose. Our research group recently isolated from soil the oleaginous yeast Papiliotrema laurentii UFV-1, which grows and produces lipids from this effluent, paving the way toward its application in third-generation biodiesel production. Nevertheless, increasing lipid production parameters is pivotal to make the bioprocess feasible. Over the last years, metabolic engineering has contributed to enhance the fermentative performance of yeasts in bioprocesses. However, improving lipid production by P. laurentii UFV-1 through metabolic engineering strategies is not a trivial task, as the proteins involved with lactose metabolism are so far unknown. Therefore, the identification of the genes responsible for lactose metabolism in P. laurentii UFV-1 is required for applying metabolic engineering strategies to increase lipid production on lactose-rich substrates, such as ricotta whey. Thus, this study aimed to identify and analyze the expression of the genes encoding putative lactose permeases and the β-galactosidase enzymes in P. laurentii UFV-1. By using bioinformatics tools, we identified the genes encoding lactose permease (Papla_5974) and β-galactosidase (Papla_5976). Surprisingly, we also identified a transcription factor gene (Papla_5975) between both genes. The three genes are on the same chromosome near each other, constituting a gene cluster. To evaluate the expression of these genes, we cultivated P. laurentii UFV-1 in Yeast Nitrogen Base (YNB) medium containing glucose, galactose, or lactose as the sole carbon sources. Besides, we cultivated this yeast in a YNB medium containing two carbon sources: glucose and lactose, and glucose and galactose. We quantified the gene expression via RT-qPCR at different growth stages. The lactose permease gene was induced in the presence of both lactose and galactose; otherwise, the β- galactosidase gene was induced only by lactose. For instance, it is unclear whether the transcriptional factor is involved in the activation of the genes encoding lactose permease and β-galactosidase. Notably, the expression of the transcriptional factor increased in the late stationary phase for glucose and lactose; thus, it may play a role under nutrient-limiting conditions. Furthermore, P. laurentii UFV-1 exhibited diauxic growth, which is consistent with the repression of the lactose permease and β-galactosidase genes by glucose in cultivations with glucose plus lactose and glucose plus galactose. Therefore, we describe for the first time a cluster of genes related to lactose metabolism in a Basidiomycota yeast, opening perspectives to improve lipid production by lactose-based media such as ricotta whey. Keywords: Ricotta whey. Lactose. Oleaginous yeast. Lipid production. Cluster genes
Isolamento, identificação e caracterização de um vírus ssDNA circular associado a Momordica charantia
(Universidade Federal de Viçosa, 2015-03-19) Páez, Lina Marcela Cortés; Zerbini, Poliane Alfenas
Vírus que possuem genoma constituído por DNA fita simples (ssDNA) estão amplamente distribuídos na natureza. As constantes descobertas aliadas à grande diversidade genética desses vírus têm ampliado a compreensão sobre a trajetória evolutiva desse grupo. No Brasil, os vírus DNA fita simples circular causam grandes perdas nas culturas de importância agrícola. Um dos fatores que contribuiu fortemente para o desastre econômico é a transmissão de vírus, onde o maior hospedeiro deles são as plantas não cultivadas. Desde então, diversos trabalhos têm sido publicados tratando de assuntos como diversidade, caracterização, determinação da gama de hospedeiros, interações entre planta e patógeno assim como patógeno e vetor, evolução, predominância, epidemiologia, dentre outros. O presente trabalho teve como objetivo isolar, identificar e caracteriza um novo vírus de ssDNA associado a Melão de São Caetano (Momordica charantia), uma cucurbitácea não cultivada e potencialmente invasiva em cultivos agrícolas no Brasil. A amostra foi coletada em Coimbra, MG- Brasil, com suspeita de ter um vírus da família Geminiviridae por apresentar sintomas de mosaico amarelo. O DNA vegetal foi extraído e analisado através da técnica de amplificação por círculo rolante, os produtos da clivagem com enzimas de restrição foram clonados e completamente sequênciados. A análise das sequências indicou que o vírus tinha um tamanho de 2195 pares de bases e uma organização genômica que apresentava três proteínas: uma codificando o capsídeo do vírus (CP) e duas relac ionada com a replicação (Rep) separadas por um íntron, que a ser removido por inspeção manual codifica a proteína completa. Essa organização em conjunto com as análises do genoma completo mostraram uma identidade com vários isolados do gênero Gemycircularvirus, sendo proposto para esse novo vírus o nome de Momordica charantia associated circular DNA virus (MCasCV). Interessantemente, MCasCV tem uma característica única dentro dos novos ssDNA: um nonanucleotídeo (5'- TAATGTTAT-3') similar ao Hypericum japonicum associated circular DNA virus (HJasCV), com uma formação de um grampo ou “stem- loop” atípico pela ligação de três pares de base encontradas na estrutura. Com o objetivo de caracterizar a biologia do vírus MCasCV foram infectadas plantas de M. charantia e o fungo Sclerotinia sclerotiorum. Para isso, plantas foram bombardeadas com partículas do clone infeccioso de MCasCV e se observou após 21 dias que não apresentaram sintomas visíveis. A confirmação da presença viral foi realizada pelas técnicas de RCA e PCR obtendo um resultado negativo. Para inoculação do vírus em Sclerotinia sclerotiorum, foram transfectados protoplastos desse fungo junto ao clone infeccioso, após o crescimento foi realizada uma extração de DNA total, seguida da confirmação por PCR e RCA, que ao igual da planta os resultados foram negativos. Fatos que podem explicar esse resultado é a ocorrência de falhas no processo de transfecção, ou a não capacidade do vírus de replicar no interior do fungo utilizado. Novas análises de infectividade d everão ser realizadas para a confirmação do hospedeiro do vírus MCasCV.
Sistemas de recuperação de ribossomos em Actinobacillus pleuropneumoniae: papel em virulência e resposta a diferentes condições de estresse
(Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-27) Teixeira, Ana Carolina Nery; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/1967721199398909
A pleuropneumonia suína é uma doença respiratória causada pelo patógeno bacteriano Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) cujo sucesso na colonização e permanência nos pulmões do suíno está relacionado à sua capacidade de resistência a diferentes condições de estresse e a inúmeros fatores de virulência. Para o sucesso do patógeno, a síntese proteica eficiente é um gargalo, uma vez que este processo pode ser um fator limitante durante o crescimento e replicação bacterianos, e para isso há uma expressiva necessidade de ribossomos ativos dentro da célula. Em condições de estresse, os ribossomos podem ficar parados em uma fita de mRNA quando um códon de parada não é detectado, precisando, portanto, de um resgate ativo em um processo chamado trans-tradução. Um RNA pequeno denominado tmRNA, ubíquo em bactérias, codificado pelo gene ssrA, é responsável por mediar o mecanismo de trans-tradução. Muitas bactérias ainda apresentam dois sistemas adicionais mediados pelo fator de resgate alternativo A (alternative rescue factor A), ArfA, descrito em outras bactérias como Escherichia coli, Salmonella enterica e Yersinia pestis e o fator de recuperação alternativo B (alternative rescue factor B), ArfB presente em 34% dos genomas bacterianos já sequenciados. Este trabalho teve como objetivos investigar qual(is) sistema(s) de recuperação de ribossomos está(ão) presente(s) em A. pleuropneumoniae e qual o envolvimento deste(s) na virulência e na resposta a diferentes condições de estresse. Análises in silico e in vitro foram conduzidas com este propósito. Nossos resultados in silico mostraram que A. pleuropneumoniae possui apenas dois sistemas de recuperação de ribossomos, e o fato de não conseguirmos a obtenção de uma linhagem duplo mutante (∆ssrA_∆arfA) valida nosso resultado. Para verificar o envolvimento destes genes em virulência e resposta a condições de estresse, linhagens mutantes denominadas ∆ssrA e ∆arfA, bem como linhagens complementadas para as respectivas linhagens, ∆ssrAC e ∆arfAC, respectivamente, foram construídas a partir da linhagem APP MIDG2331 WT (sorotipo 8). Estas linhagens (WT, mutantes e complementadas) foram investigadas quanto ao crescimento in vitro, adesão, sensibilidade a antibióticos e a diferentes condições de estresse (oxidativo, osmótico, temperatura e etanólico). Além disso, a virulência destas linhagens foi analisada no modelo de infecção alternativo Galleria mellonella. Análises fenotípicas mostraram que o mutante ∆ssrA foi mais sensível antibióticos e a todas as condições de estresse se comparado à linhagem WT e ao mutante ∆arfA. Além disso, o mutante ∆ssrA apresentou menor capacidade de adesão e virulência atenuada em G. mellonella quando comparada com as linhagens WT e ∆arfA. A linhagem ∆ssrAC não mostrou uma restauração completa do fenótipo original. Entretanto, a linhagem ∆arfAC mostra uma restauração completa do fenótipo. Estes resultados mostram que o gene ssrA tem um papel importante na resistência ao estresse e na virulência em APP e a ausência do gene arfA não afetou o fitness da bactéria nas condições avaliadas. Diante desses resultados, podemos concluir que o sistema TmRNA/SmpB é o principal sistema de recuperação de ribossomos em A. pleuropneumoniae e que a falta do mesmo acarreta em atenuação do fenótipo de virulência e aumento da sensibilidade a condições de estresse.
Solubilização de fosfatos de rocha por Penicillium islandicum
(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-23) Bonduki, Victor Hugo Araújo; Costa, Maurício Dutra; http://lattes.cnpq.br/0594143652004072
O consumo de fertilizantes minerais aumenta anualmente com vistas a melhorar a produtividade das lavouras. Os fertilizantes fosfatados estão entre os mais comercializados em razão da importância do fósforo (P) para o crescimento, o desenvolvimento e a produção vegetal em solos empobrecidos desse nutriente. Nos solos brasileiros, a disponibilidade de P é baixa e, na maioria das vezes, o elemento torna-se inacessível às raízes em face de sua retenção nos minerais de argila. Para contornar esse problema, o uso de fontes alternativas de P em substituição aos fertilizantes solúveis dispendiosos têm sido estudadas. Para suprir a demanda de mercado, os fosfatos naturais ou de rocha (FRs), fontes de P, são tratados por processos químicos e térmicos de elevado custo energético que causam poluição. Os FRs brasileiros são de baixa reatividade, fazendo com que o seu processamento seja mais oneroso. Esse fato desestimula o uso de reservas de rocha fosfáticas nacionais, levando à importação de FRs estrangeiros de maior reatividade. Uma alternativa viável para o uso de FRs brasileiros é a utilização de microrganismos com capacidade de solubilizar esse material por meio de processos biológicos de acidificação do meio e complexação de cátions. A solubilização microbiana tem também a vantagem de permitir a utilização de substratos sólidos para o crescimento microbiano, geralmente rejeitos ou resíduos da indústria agrícola. O objetivo do presente trabalho foi o de estudar a solubilização microbiana de FRs por P. islandicum FS41 em meios líquidos e em sistema de fermentação em substrato sólido com bagaço de cana-de-açúcar. A capacidade fúngica de solubilizar os FRs de Araxá, Catalão, Patos de Minas, Bayóvar e Argélia foi testada neste trabalho. O P. islandicum FS41 imobilizou o P liberado em meio Strasser, em fermentação em substrato sólido, quando na presença dos FRs de Araxá, Catalão e Patos de Minas. Os FRs Argélia e Bayóvar apresentaram valores baixos de P em solução, correspondendo a 18,9 e 9,8 mg L-1, respectivamente. A diminuição da disponibilidade de nitrogênio, atrelada à utilização de fontes amoniacais no meio Strasser, no sistema de fermentação em substrato sólido, promoveu aumentos do P em solução para os FRs Argélia, Bayóvar, Patos de Minas e Araxá. A ausência de fontes nitrogenadas ixinorgânicas e de extrato de levedura, no meio Strasser e no mesmo sistema de fermentação, favoreceu a liberação de P a partir do FR de Araxá, com valor de P em solução de 47,9 mg L-1 ou cerca de 11 % de solubilização. A solubilização dos FRs por P. islandicum FS41 foi mais eficiente em meio NBRIP do que no meio Strasser em sistema de cultivo em batelada em meio líquido, com valores médios de P em solução de 96,7, 79,7, 26,9, 23,2 e 22,3 mg L-1 para os FRs Argélia, Bayóvar, Patos de Minas, Catalão e Araxá, respectivamente. Alternativamente, o pré-cultivo de P. islandicum FS41 e a posterior transferência da biomassa micelial produzida para meio de solubilização com baixa disponibilidade de nutrientes minerais resultou em valores de P em solução de 130 mg L-1, o que correspondeu a 30 % de solubilização do P contido no FR de Araxá. Essa última estratégia promoveu aumentos de 2,71 a 5,8 vezes do P em solução em comparação aos valores obtidos nos experimentos anteriores. Diferentemente de outros fungos solubilizadores de fosfato, P. islandicum FS41 mostrou-se mais eficiente na produção de biomassa micelial, com forte tendência de imobilização do P liberado dos FRs. O presente trabalho aponta algumas alternativas de se contornar esse problema. No entanto, esforços adicionais deverão ser conduzidos para a otimização do processo de solubilização de FRs por esse fungo.