Microbiologia Agrícola
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Item Análise da diversidade genética de isolados de Phaeoisariopsis griseola por meio de marcadores moleculares(Universidade Federal de Viçosa, 2007-08-15) Abadio, Ana Karina Rodrigues; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Salomão, Tânia Maria Fernandes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787017A5; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4704734Y2; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Pereira, Olinto Liparini; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767879D4A mancha-angular, causada pelo fungo Phaeoisariopsis griseola, também conhecido como Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun, é uma das doenças mais importantes que ocorre no feijoeiro, causando sérios prejuízos na produção. A forma mais econômica de controle dessa doença é a utilização de cultivares resistentes. Entretanto, estudos relacionados à diversidade genética de P. griseola têm demonstrado grande variabilidade genética nesse fungo, o que tem dificultado a obtenção dessas cultivares. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi verificar se as técnicas ERIC-PCR, BOX-PCR, ISSR-PCR e PCR-RFLP da região ITS do rDNA são apropriadas para a detecção de polimorfismos genéticos que permitam estimar a diversidade genética de isolados de P. griseola provenientes dos estados de Goiás, Minas Gerais, Espírito Santo e Paraná. O DNA total de 29 isolados de P. griseola foi extraído e, posteriormente, utilizado para amplificação de seqüências ERIC, BOX, ISSR e ITS utilizando oligonucleotídeos específicos. As clivagens da região ITS com as enzimas de restrição AluI, HaeIII, HhaI, HpaII, MboI, MspI e RsaI produziram perfis de restrição idênticos para todos os isolados, e, portanto, a sequência ITS nas condições empregadas não forneceu marcadores que pudessem diferenciar os isolados de P. griseola. Por meio da análise de agrupamento dos resultados obtidos pelas técnicas BOX-PCR, ERIC-PCR e ISSR-PCR, foram detectados 2, 5 e 28 genótipos, respectivamente, entre os isolados estudados. Os resultados obtidos mostraram que as técnicas BOX-PCR e ERIC-PCR foram menos eficientes na detecção de polimorfismo genético entre os isolados de P. griseola. Os melhores resultados foram obtidos com o emprego da técnica ISSR- PCR, que mostrou grande capacidade de detecção de marcadores polimórficos entre os isolados. A diversidade genética estimada poderá auxiliar no desenvolvimento de estratégias adequadas para a obtenção de variedades de feijoeiro resistentes a esse fungo.Item Caracterização do elemento transponível Boto em Moniliophthora perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao)(Universidade Federal de Viçosa, 2009-02-20) Almeida, Ana Paula Morais Martins; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://lattes.cnpq.br/8760383540033518; Brommonschenkel, Sérgio Hermínio; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780948Y4; Coelho, Irene da Silva; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4735662J0O basidiomiceto hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao) apresenta diferentes elementos transponíveis em seu genoma. Um elemento transponível da Classe II pertencente à superfamília PIF/Harbinger, denominado Boto, foi parcialmente caracterizado em estudos anteriores. O elemento Boto, assim como os demais elementos PIF/Harbinger, apresenta duas ORFs (Open Reading Frame), uma que codifica a transposase e outra, denominada ORF 1, cuja seqüência de aminoácidos deduzida representa uma proteína de função é desconhecida. Este trabalho foi conduzido com o objetivo de comprovar a atividade de Boto e caracterizar a ORF 1. Para a confirmação da atividade do elemento transponível Boto no genoma de M. perniciosa realizou-se a avaliação do perfil de integração em isolados resultantes do ciclo sexual, isto é, obtidos a partir da germinação de basidiósporos. Três isolados apresentaram variação no número de cópias, demonstrando a atividade de Boto. Foi realizado PCR para detecção dos sítios de inserção deste elemento em diferentes isolados. Dentre os 28 isolados utilizados no experimento, 14 apresentaram produtos de amplificação com o tamanho esperado. Os produtos de amplificação de dois isolados, escolhidos aleatoriamente, foram clonados e seqüenciados. Na análise das seqüências obtidas, verificou-se que, em ambos os isolados sequenciados, o elemento Boto provavelmente não sofreu transposição para os sítios analisados no genoma de M. perniciosa. Isto comprova a atividade deste elemento, pois, no isolado usado como referência para este estudo, o elemento Boto estava inserido naquela posição. Na análise da seqüência da ORF 1, verificou-se a presença de dois possíveis íntrons, um contendo 55 pb e outro de 48 pb. Esta seqüência codifica uma proteína de 422 resíduos de aminoácidos. Para comprovar a presença dos íntrons, experimentos de RT-PCR foram realizados com a utilização de dois conjuntos de oligonucleotídeos. Os amplificados obtidos, quando cDNA foi utilizado como molde da reação de PCR, foram clonados e sequenciados, sendo confirmada a posição e o tamanho dos dois íntrons preditos. Análise de RT-PCR mostrou que esta ORF é expressa mesmo em condições normais de cultivo do fungo, o que é importante para atividade deste elemento, visto que outros estudos mostram que a expressão desta ORF é fundamental à transposição de elementos PIF/Harbinger. Os resultados deste trabalho mostram que Boto é ativo no genoma de M. perniciosa e pode ter um importante papel como agente gerador de variabilidade genética neste fitopatógeno. Vale ressaltar que esta é a primeira descrição de um elemento da superfamília PIF/Harbinger que apresenta dois íntrons na ORF 1.Item Caracterização estrutural do gene que codifica a histidina quinase slnCl1 e sua relação com a patogenicidade, osmorregulação e resistência a fungicidas em Colletotrichum lindemuthianum(Universidade Federal de Viçosa, 2009-10-01) Santos, Leandro Vieira dos; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Costa, Maurício Dutra; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728228J5; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://lattes.cnpq.br/6507172974225755; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Pereira, Olinto Liparini; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767879D4O fungo filamentoso Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magnus) Briosi & Cav., agente causal da antracnose, é um importante patógeno do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.). Esse fungo é um excelente modelo de estudo para o entendimento do processo de infecção de fungos fitopatogênicos. Por meio de mutagênese por inserção de plasmídeo foi obtido um mutante (LVSa1) não patogênico de C. lindemuthianum com deficiência parcial na produção de melanina. O objetivo desse trabalho foi isolar e caracterizar o gene interrompido no mutante LVSa1 e comprovar a sua importância no processo de infecção da planta. O gene mutado foi isolado de um banco genômico de C. lindemuthianum e denominado slnCl1. A análise da sequência revelou que slnCl1 codifica uma histidina quinase. A sequência apresenta uma ORF de 3555 pares de bases, interrompida por três íntrons putativos, contendo 51, 87 e 89 pb. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida da proteína, com sequências de todas as classes de histidinas quinases disponíveis nos bancos de dados agrupou SlnCl1 na classe VI, possuindo regiões extremamente conservadas características de histidina quinases e relacionadas a sua função. Por meio de mutagênese insercional sítio dirigida utilizando um fragmento do gene, foi obtido um mutante que apresentou deficiência parcial na produção de melanina. Esse mutante apresentou uma redução significativa na capacidade de infectar folhas de feijoeiro, demonstrando que SlnCl1 é importante no processo de patogenicidade desse fungo. Como muitas histidinas quinases já descritas em fungos, SlnCl1 apresenta envolvimento no processo de osmorregulação e adaptação a diferentes concentrações osmóticas em C. lindemuthianum. Além disso, por meio dessa proteína sensora, o fungo pode distinguir o estresse osmótico causado por altas concentrações de açúcares e de sais. O mutante mostrou-se sensível a fungicidas que tem como alvo uma via de sinalização MAPK, provavelmente regulada por slnCl1. Os resultados obtidos sugerem que C. lindemuthianum deve possuir outras histidinas quinases envolvidas no processo de osmorregulação. O estudo da cascata de sinalização regulada por slnCl1 pode representar um grande avanço no entendimento do processo de patogenicidade e na elaboração de novos métodos de combate a doença.Item Clonagem e caracterização do gene que codifica a nitrato redutase em Colletotrichum lindemuthianum, patógeno do feijoeiro (Phaseolus vulgaris)(Universidade Federal de Viçosa, 2006-08-28) Ribeiro, Ronney Adriano; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Moraes, Célia Alencar de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781007D6; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4702817J2; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Ribon, Andréa de Oliveira Barros; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026E6O gene que codifica para a nitrato redutase de Colletotrichum lindemuthianum, nit1, foi isolado e caracterizado. Sua seqüência e regulação em resposta a diferentes fontes de nitrogênio foram analisadas. A análise da seqüência do gene nit1 indicou que ele possui 2.787 pb com um único íntron de 69 pb iniciando no nucleotídeo 1.808. Este íntron está localizado numa região conservada de íntrons presentes no gene da nitrato redutase em outros fungos. No entanto, a identidade entre eles se restringe às regiões consenso responsáveis pela excisão. A região reguladora do gene nit1, além das seqüências consenso gerais, apresenta quatro seqüências TATC responsáveis pela ligação da proteína reguladora geral positiva NIT2. Um possível sítio da ligação da proteína reguladora da via específica, NIT4, também foi localizado nessa região, na posição -340. Além disso, na região 3 não traduzida foi encontrado um possível sítio para poliadenilação do mRNA localizado na posição 2.826. A proteína deduzida do gene nit1 gerou uma seqüência de 905 aminoácidos com massa molecular de 101,1 kDa e apresentou alta identidade com as proteínas correspondentes em Metarhizium anisopliae (62,43%), Magnaporthe grisea (62,27%), Verticillium fungicola (60,15%), Botryotinia fuckeliana (58,30%) e Aspergillus fumigatus (51,93%). A expressão do gene nit1 em C. lindemuthianum foi avaliada em micélios cultivados em diferentes fontes de nitrogênio, em condições de ativação e repressão. O gene foi expresso na presença de nitrato a partir de 15 minutos após entrar em contato com esta fonte de nitrogênio, tendo atingido a expressão máxima com 360 minutos. A transcrição foi reprimida em micélios cultivados em amônio, uréia e glutamina. Em glutamina, após 60 minutos de repressão, não foi possível detectar a presença de transcritos desse gene.Item Clonagem e caracterização dos genes que codificam endo-xilogalacturonana hidrolase, o fator de transcrição PacC e a proteína PalA em Crinipellis perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa em Theobroma cacao(Universidade Federal de Viçosa, 2007-01-19) Silva, Gilvan Ferreira da; Cascardo, Júlio Cezar Mattos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4723204T2; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://lattes.cnpq.br/1000535673605322; Moraes, Célia Alencar de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781007D6; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6Crinipellis perniciosa é o agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro, e em outras espécies do gênero Theobroma, causando danos na cultura do cacau e cupuaçu com grande impacto econômico. Neste trabalho, descrevem-se o isolamento e a caracterização dos genes que codificam endoxilogalacturonana hidrolase (Xgh), PalA e PacC. O gene xghCp possui uma região codificadora de 1.251 pares de bases, interrompida por quatro possíveis íntrons. A proteína deduzida apresenta 417 aminoácidos, sendo codificada por um gene cópia única. A transcrição do gene foi analisada por meio da técnica de RT-PCR, sendo avaliados os efeitos do pH e das fontes de carbono glicose e pectina. A transcrição do gene não foi reprimida por glicose 1%. Em presença de pectina os transcritos do gene xghCp foram detectados em pHs variando de 4,0 a 8,0. Na análise filogenética da proteína deduzida, XghCp agrupou-se com endo-xilogalacturonana hidrolase de Aspergillus tubingensis, Aspergillus niger e duas enzimas similares a Xgh de Aspergillus fumigatus. O alinhamento múltiplo revelou que XghCp apresenta, na região correspondente ao sítio de ligação ao substrato de poligalacturonase, a seqüência GIK (Gy-Ile-Lys) que foi comum a todas as endo-xilogalacturonanas hidrolase analisadas. Este é o primeiro relato de endo-xilogalacturonana hidrolase em basidiomiceto. Neste trabalho também foi realizada a clonagem e caracterização dos genes palA e pacC, relacionados à transdução de sinal em resposta ao pH em C. perniciosa. A transcrição do gene palACp não é regulada por pH e a proteína deduzida apresentou o domínio conservado BRO1. A análise filogenética mostrou que esta proteína é conservada de fungos a humanos. Foram seqüenciados 4.347 pb correspondentes ao gene pacCCp, que apresentou uma ORF de 2.472 pb interrompida por 8 íntrons putativos. Na região promotora, foram localizados três possíveis sítios de reconhecimento para PacCCp (5 GCCAG3 ), o que sugere um sistema de auto-indução deste gene em pH alcalino. Os transcritos do gene pacCCp foram detectados por RT-PCR em pH 6,8 e 8,0 em 8, 18 e 32 horas após a indução. Em pH 4,0, foi observada a transcrição basal no período de 8 a 32 horas. A seqüência deduzida apresentou 824 aminoácidos, com domínios dedos de zinco extremamente conservados em leveduras e fungos filamentosos. Motivos de reconhecimento proteína-proteína YPXL/I de interação com PalA foram localizados na região C-terminal da proteína PacCCp entre os aminoácidos 637 e 742. A identificação dos genes pacC e palA sugere que C. perniciosa, apresenta a cascata de sinalização em resposta ao pH.Item Diversidade de fungos endofíticos de folhas de soja (Glycine max) cultivada em Viçosa – MG(Universidade Federal de Viçosa, 2010-07-27) Leite, Tiago de Souza; Pereira, Olinto Liparini; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767879D4; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://lattes.cnpq.br/0443259593714653; Brommonschenkel, Sérgio Hermínio; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780948Y4; Kasuya, Maria Catarina Megumi; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4721444T5; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6A soja é uma das mais importantes culturas agrícolas mundiais, sendo utilizada principalmente na alimentação humana e de animais. Os fungos endofíticos são micro-organismos que habitam o interior do tecido vegetal durante alguma fase do seu ciclo de vida, mas sem causar doença aparente ao hospedeiro. Muitos trabalhos têm mostrado o potencial do uso de fungos endofíticos como agentes no controle biológico de doenças e pragas em plantas, na indução de resistência sistêmica e na promoção de crescimento vegetal. O objetivo deste estudo foi isolar e identificar os fungos endofíticos de folhas de soja das cultivares Conquista e Monsoy, utilizando duas técnicas de isolamento, a fragmentação do tecido e a técnica de cultivo por extinção, para determinar a riqueza de espécies e comparar a diversidade de fungos encontrados entre as cultivares. Um total de 188 morfotipos foram obtidos representando 52 taxa identificados pela região ITS do rDNA. O filo Ascomycota foi o dominante, representado por 99 e 96 % dos isolados para as cultivares Monsoy e Conquista, respectivamente, enquanto o filo Basidiomycota foi representado por 1 e 4 % dos isolados, para as mesmas cultivares. A riqueza de espécies para a cultivar Monsoy (31 espécies) e para a cultivar Conquista (37 espécies) foi maior quando ambas as técnicas de isolamento foram utilizadas. A diversidade de fungos endofíticos foi semelhante para ambas as cultivares, utilizando a mesma técnica de isolamento. A utilização das sequências da região ITS para a análise filogenética permitiu o agrupamento dos isolados fúngicos de acordo com a sua respectiva Ordem (quando definida), Classe e Filo. Esse é o primeiro trabalho que utiliza a técnica de cultivo por extinção para o isolamento de fungos endofíticos da soja.Item Diversidade genética, antagonismo microbiano e produção de fitases por bactérias endofíticas de folhas de feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris)(Universidade Federal de Viçosa, 2010-10-29) Costa, Leonardo Emanuel de Oliveira; Borges, Arnaldo Chaer; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783573Z8; Moraes, Célia Alencar de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781007D6; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4744676Z8; Nascimento, Antonio Galvão do; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4797432E8; Tótola, Marcos Rogério; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727020U4; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; Azevedo, João Lúcio de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4793677J6O feijão é uma das leguminosas mais importantes para a alimentação humana e pouco se conhece sobre as bactérias endofíticas associadas com as folhas desta planta. Objetivou-se com este trabalho: (i) caracterizar as bactérias endofíticas cultiváveis das folhas do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris) de três cultivares diferentes (Vermelhinho, Talismã e Ouro negro), plantadas sob as mesmas condições de campo; (ii) avaliar a produção de sideróforos e enzimas líticas (pectinase, celulase e protease) destes isolados, bem como o potencial de antagonismo contra os fungos fitopatogênicos Colletotrichum lindemuthianum, Rhizoctonia solani e Fusarium oxysporum, agentes causais da antracnose, podridão-radicular e murcha-de-fusário-do-feijoeiro, respectivamente; e (iii) avaliar a capacidade dos isolados de produzir fitases e caracterizar estas enzimas. Foram obtidos 158 isolados, sendo que 36,7 %, 32,9 %, 29,7 % e 0,6 % pertencem aos Filos Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria e Bacteroidetes, respectivamente. Baseado nas sequências do gene rDNA 16S, 23 gêneros e 45 espécies diferentes foram isolados. As três cultivares de P. vulgaris mostraram diferenças na diversidade das classes Actinobacteria, Alphaproteobacteria e Bacilli, sendo que os isolados da cultivar Talismã apresentaram menor diversidade do que os isolados das outras duas cultivares. Estes resultados indicam que a cultivar influencia a estrutura das comunidades endofíticas associadas ao feijoeiro comum. Dentre os 158 isolados analisados, 20 isolados produzem celulase, oito produzem pectinases e 96 produzem proteases. Adicionado a isso, 49 isolados apresentaram algum nível de antagonismo contra pelo menos um dos fungos analisados. Dois isolados do gênero Pseudomonas e quatro isolados do gênero Stenotrophomonas apresentaram resultados mais promissores. Dezesseis isolados são produtores de sideróforos, sendo este o primeiro relato de produção de sideróforos por uma linhagem da espécie Agromyces mediolanus. Quarenta e cinco isolados são produtores de fitase, sendo que quatro foram selecionados para caracterização da atividade da enzima. As fitases dos quatro isolados apresentaram atividade de fosfatase com outros substratos como ATP, ADP, pirofosfato e β-glicerofosfato, porém sua maior atividade foi observada em presença de fitato. Outra característica incomum das fitases analisadas é a presença de mais de um pH ótimo de atividade. Este é o primeiro relato de produção de fitase por bactérias do gênero Rhodococcus e Microbacterium. Os gêneros Bacillus, Delftia, Paenibacillus, Methylobacterium, Microbacterium, Staphylococcus e Stenotrophomonas estão presentes nas três cultivares avaliadas, evidenciando a adaptação destes gêneros a diferentes cultivares. O estudo dos microrganismos endofíticos do feijoeiro se mostrou promissor para obtenção de bactérias com potencial para o controle biológico de patógenos e bactérias produtoras de fitase.Item Fungos endofíticos de Phaseolus vulgaris exibem atividade antimicrobiana e potencial para controle de fitopatógenos(Universidade Federal de Viçosa, 2014-02-20) Santos, Taides Tavares dos; Pereira, Olinto Liparini; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767879D4; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://lattes.cnpq.br/0619959327505427; Ramos, Humberto Josué de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/4037452920080174Fungos endofíticos são aqueles que vivem, em pelo menos uma parte de seu ciclo de vida, no interior de tecidos vegetais, sem causar aparentemente qualquer dano a seus hospedeiros. Esses micro-organismos têm sido estudados em relação à capacidade de produzirem metabólitos secundários de interesse biotecnológico e quanto ao potencial de controle biológico de fitopatógenos. Fungos endofíticos já foram isolados de uma ampla variedade de espécies vegetais, incluindo culturas agrícolas como o feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.). O gênero Diaporthe foi um dos mais abundantes na comunidade endofítica dessa leguminosa. Os objetivos do presente estudo foram avaliar a atividade antimicrobiana e o potencial de uso de fungos endofíticos de P. vulgaris no controle de fitopatógenos da cultura do feijoeiro e analisar as relações filogenéticas e a variabilidade genética de fungos endofíticos do gênero Diaporthe isolados de P. vulgaris. Ensaios de cultura dupla entre 90 isolados endofíticos e quatro fungos fitopatogênicos (Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum) foram realizados para verificar a capacidade dos isolados endofíticos inibirem o crescimento dos fitopatógenos. Os isolados que foram capazes de inibir os quatro fitopatógenos testados foram selecionados para cultivo e obtenção de extratos brutos de metabólitos. Esses extratos foram avaliados quanto à atividade antibacteriana e antifúngica. As sequências da região ITS do rDNA dos isolados do gênero Diaporthe do feijoeiro, juntamente com as sequências parciais dos genes codificam o fator de elongação da tradução 1-α, β-tubulina e calmodulina, foram utilizadas para o estudo das relações filogenéticas desses isolados. Marcadores moleculares baseados em sequências de retrotransposons, IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) e REMAP (Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism), foram utilizados para a análise de variabilidade genética. Foi constatado que os fungos endofíticos do feijoeiro comum são capazes de inibir o crescimento in vitro de fungos fitopatogênicos e, que extratos brutos de metabólitos de isolados endofíticos exibem atividade antimicrobiana significativa, principalmente em relação à atividade inibitória sobre bactérias Gram-positivas (Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, B. subtilis e Staphylococcus aureus). Por meio de análise filogenética multilocus, verificou-se que Diaporthe sp., D. infecunda, D. melonis e D. phaseolorum são integrantes da comunidade fúngica endofítica do feijoeiro comum. A análise de agrupamento, realizada com os dados dos marcadores IRAP e REMAP em conjunto, foi coerente em relação ao que foi verificado na filogenia multilocus e, revelou a existência de grande variabilidade genética, sobretudo entre os isolados de D. infecunda. Concluiu-se que extratos brutos de metabólitos de fungos endofíticos do feijoeiro exibem atividade antimicrobiana promissora; que fungos endofíticos utilizados neste estudo apresentam potencial para controle de fitopatógenos que acometem a cultura do feijoeiro; que a abordagem filogenética multilocus foi mais efetiva que análise individual de sequências de ITS no estudo das relações filogenéticas de fungos endofíticos do gênero Diaporthe do feijoeiro e que marcadores IRAP e REMAP podem ser empregados no estudo de variabilidade genética de fungos desse gênero.Item Genes determinantes de patogenicidade e virulência e análise parcial do genoma mitocondrial de Colletotrichum lindemuthianum, agente causal da antracnose do feijoeiro comum(Universidade Federal de Viçosa, 2007-03-23) Soares, Marcos Antônio; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4776663D4; Rodrigues, Fabrício de ávila; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4709080E6; Souza, Elaine Aparecida; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782465Z5Colletotrichum lindemuthianum é um dos principais patógenos do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris) em regiões tropicais. Nesse trabalho são descritos três mutantes de C. lindemuthianum obtidos por mutagênese insercional usando a técnica REMI (Integração Mediada por Enzima de Restrição), com a capacidade alterada de infectar o hospedeiro, e a caracterização parcial dos genes mutados; é determinado o papel do gene pacC1 no crescimento vegetativo e na patogenicidade; além da caracterização parcial do genoma mitocondrial desse fitopatógeno. A utilização de enzima de restrição NarI na transformação de C. lindemuthianum aumentou aproximadamente 10X a eficiência de transformação com o plasmídeo pAN7.1. Os mutantes mut5, mut29 e mut 65, isolados do banco de 580 transformantes, apresentaram alteração na capacidade de infecção do feijoeiro. Não foi observada a penetração das linhagens mut29 e mut65 no tecido do hipocótilo, apesar dessas linhagens causarem sintomas da antracnose nas folhas do feijoeiro. Esse resultado indica que as linhagens mut29 e mut65 apresentam fenótipo variável de acordo com o tecido vegetal utilizado nas observações de infecção. Após o sequenciamento dos plasmídeos recuperados de mut29 e mut65, pôde-se comprovar que a integração do vetor pAN7.1 foi mediada pela enzima NarI, o que caracteriza eventos REMI. As análises das seqüências mostraram que o gene que codificam tetrahidrofolato sintase (tlsCl) foi interrompido pelo vetor no mut65. Um putativo gene codificador para fosfolipaseC (plcCl) está etiquetado no mut29. Essa ultima linhagem possui uma segunda integração na região terminal 3 do gene com homologia ao transportador do tipo MSF (msfCl). Esse é o primeiro relato desses genes em C. lindemuthianum. Os fatores de transcrição da família PacC/Rim101 de fungos e leveduras são responsáveis pela ativação ou repressão de genes em resposta ao pH extracelular. A ativação desses fatores de transcrição depende de uma via de transdução de sinal capaz de perceber variações do pH externo, e transmitir esse sinal até a ativação do fator de transcrição. Foi descrita a seqüência do cDNA do gene pacCl, isolada a partir de uma banco genômico de EST de C. lindemuthianum. A proteína predita de 581 aminoácidos possui alta similaridade com proteínas da família de reguladores de transcrição PacC/Rim101 e sua região N-terminal possui 3 motivos dedo de zinco, do tipo Cys2Hys2. A transcrição de pacC1 aumentou à medida que o pH ambiental tornou-se mais alcalino. O crescimento do mutante nulo mutpac2 foi inibido em ambientes mais alcalinos, apresentando secreção de pequena quantidade de lipase, e este não foi capaz de causar maceração do tecido do hospedeiro, indicando o seu papel na patogenicidade de C. lindemuthianum. A transcrição de pacCl foi detectada por RT-PCR na linhagem selvagem, 18 h após a inoculação de plantas de feijoeiro e aumentou progressivamente com a biomassa fúngica durante a cinética de infecção. Outros dois cDNAs, codificando proteínas homólogas às famílas protéicas PalA/Rim20 e PalF/Rim8 de fungos e leveduras, que fazem parte da via de transdução de sinais, também foram descritos. A detecção de genes regulados positivamente por PacCl, na transição da fase biotrófica para a necrotrófica, poderá auxiliar o entendimento dos mecanismos moleculares que levam a essa transição em fungos hemibiotrófico, e, consequentemente, a proposição de estratégias de controle da doença. Utilizando-se uma técnica de hibridização diferencial capaz de identificar DNA altamente repetido, foi isolado um fragmento de 9.456 pb correspondendo à seqüência parcial do genoma mitocondrial de C. lindemuthinum. Esse fragmento possui alto conteúdo A+T (66%), e nele estão presentes os genes cox1, cox3, nad6, rnl, rns, e 12 outros genes codificando para tRNA. Os genes codificadores de proteínas nesse fragmento utilizam códons preferenciais. Somente o gene cox1 foi interrompido por um intron do grupo I contendo uma ORF para endonuclease do tipo LAGLIDADG, envolvida no processo de homing . A comparação da sintenia dos genes presentes nesse fragmento e análise filogenética utilizando-se três proteínas mitocondriais concatenadas de diversos fungos agrupou C. lindemuthianum com outros fungos da ordem Filacorales.Item Identificação e caracterização de elementos transponíveis da classe II em Colletotrichum graminicola(Universidade Federal de Viçosa, 2012-01-31) Braga, Raíssa Mesquita; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Brommonschenkel, Sérgio Hermínio; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780948Y4; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://lattes.cnpq.br/9447364742831088; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6Colletotrichum é um dos gêneros mais importantes de fungos fitopatogênicos em todo o mundo. As espécies fitopatogênicas desse gênero apresentam ciclo de vida hemibiotrófico e causam doenças em diversas culturas economicamente importantes. Além da importância econômica, Colletotrichum possui grande relevância como um sistema modelo para o estudo das bases celulares e moleculares da patogenicidade fúngica. A espécie Colletotrichum graminicola, agente causal da antracnose do milho (Zea mays), possui ciclo sexual raro e foi a primeira espécie do gênero a ter o seu genoma completamente sequenciado. Os elementos transponíveis são ubíquos e constituem uma fonte de novas mutações, sendo, portanto, uma importante fonte de variabilidade genética. Esses elementos são divididos em duas classes de acordo com a presença ou ausência de um intermediário de RNA na transposição. Os elementos da classe I se transpõem via intermediário de RNA, enquanto os elementos da classe II se transpõem diretamente como DNA. Os elementos transponíveis podem ser utilizados como agentes mutagênicos visando à identificação e etiquetagem de genes e em estudos filogenéticos e populacionais. Tendo em vista a importância dos elementos transponíveis na geração de variabilidade genética e as suas aplicações na pesquisa, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar elementos transponíveis da classe II no genoma de C. graminicola. Para tanto, foi utilizada uma abordagem de bioinformática (análises in silico) aliada às atividades experimentais. Foram identificadas 133 sequências completas de elementos transponíveis no genoma sequenciado de C. graminicola, que representam uma proporção relevante do genoma (0,47%). Os elementos foram classificados em 6 famílias de acordo com a identidade e apresentam características da superfamília Tc1-Mariner. Apesar de algumas transposases putativas codificadas por esses elementos possuírem domínio DDE conservado, todas estão interrompidas por vários códons de parada. Nenhum elemento identificado possui todas as características necessárias para um elemento autônomo. A análise in silico revelou evidências de mutações geradas pelo mecanismo de RIP (Mutação de ponto induzida por repetição). O elemento TCg1, amplificado por PCR a partir de um isolado brasileiro de C. graminicola, possui extremidades repetidas invertidas imperfeitas e a sequência putativa da transposase apresenta os três domínios característicos conservados: DDE, HTH e CENPB. Entretanto, essa sequência está interrompida por códons de parada e não foram localizados os códons de iniciação e de terminação, sendo, portanto, provavelmente inativa. O DNA genômico de 49 diferentes isolados foi analisado por hibridização com uma sequência derivada da região interna de TCg1 e apresentaram diferentes perfis. A estratégia utilizada permitiu uma identificação eficiente de uma variedade de elementos transponíveis Tc1-Mariner degenerados por mutações características de RIP em C. graminicola. É improvável que algum dos elementos identificados seja autônomo, entretanto, esses elementos devem possuir um importante papel na variabilidade genética desse fungo. O elemento TCg1 está presente no genoma de diferentes isolados de C. graminicola e possui potencial para ser utilizado como marcador molecular em análises populacionais.Item Identificação e caracterização dos genes abcCl1 e cypCl1 que codificam um transportador ABC e um citocromo P450 no fitopatógeno Colletotrichum lindemuthianum(Universidade Federal de Viçosa, 2009-02-20) Oliveira, Maycon Campos; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4750663U5; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; Pereira, Olinto Liparini; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767879D4Para se defenderem de fungos fitopatogênicos, as plantas produzem proteínas antifúngicas e antibióticos especializados (fitoanticipinas e fitoalexinas). Somente patógenos que conseguem evitar estas respostas defensivas da planta nos estágios iniciais da infecção são capazes de causar doença. O fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Briosi & Cavara é o agente etiológico da antracnose do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.), uma importante doença que contribui para redução da produtividade da cultura do feijoeiro no Brasil. Neste fitopatógeno foram isolados dois genes, abcCl1 e cypCl1, cujas sequências de aminoácidos deduzidas possuem alta similaridade com transportadores ABC e citocromos P450, respectivamente. Estes genes estão presentes em cópia única e agrupados no genoma do fungo, conforme revelado no sequenciamento de um fragmento de DNA de 8,4 kb da biblioteca genômica de C. lindemuthianum, bem como no perfil de hibridização. Estes genes também apresentam aumento de expressão em resposta a diferentes compostos tóxicos, principalmente quando o fungo é crescido na presença de eugenol, higromicina ou fitoalexina pisatina. Assim, além de seus genes estarem ligados fisicamente, as proteínas ABCCl1 e CYPCl1 podem, também, estarem envolvidas em um mesmo processo funcional: a resistência do fungo a compostos tóxicos produzidos por plantas ou microrganismos antagonistas. Na análise funcional do gene abcCl1, foi observado que mutantes abcCl1− apresentam redução na virulência a folhas de feijoeiro comum, em comparação com a linhagem selvagem de C. lindemuthianum. Estes resultados indicam que o gene abcCl1 codifica um transportador ABC, que é necessário para a patogenicidade de C. lindemuthianum, provavelmente por conferir ao fungo a capacidade de superar algum mecanismo de defesa da planta. O citocromo P450, codificado pelo gene cypCl1, pode representar um mecanismo complementar de destoxificação empregado por este fungo durante o estabelecimento da doença.Item Incidência e transmissão de dsRNA em Pseudocercospora griseola, agente causal da mancha-angular do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris)(Universidade Federal de Viçosa, 2008-07-29) Lima, Swiany Silveira; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Zerbini Júnior, Francisco Murilo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783743U5; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4190755A5; Kasuya, Maria Catarina Megumi; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4721444T5; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; Costa, Maurício Dutra; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728228J5O feijoeiro comum Phaseolus vulgaris apresenta grande importância alimentar e econômica para o brasileiro. No entanto, sua produtividade é baixa devido, em parte, à ocorrência de doenças. Entre essas doenças, destaca-se a mancha-angular, cujo agente causal é o fungo Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun. Micovírus ou partículas semelhantes a vírus já foram descritas em diversos fungos fitopatogênicos. Esses vírus são incapazes de penetrar e lisar as células hospedeiras, sendo a transmissão intracitoplasmática por meio da anastomose entre hifas e da esporogênese. A maior parte dos micovírus é encontrada como múltiplos fragmentos de dsRNA. Em geral, os micovírus são crípticos (latentes) em relação aos efeitos provocados no fenótipo do fungo hospedeiro, mas podem influenciar a biologia de seu hospedeiro, provocando alterações morfológicas, hiper ou hipovirulência. Por estarem associados ao fenômeno de hipovirulência, os micovírus apresentam uso potencial no biocontrole de fungos fitopatogênicos. O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar micovírus presentes em isolados de P. griseola, uma vez que recentemente estes foram detectados, pela primeira vez, nesta espécie de fungo. Para atingir este objetivo, foi realizada a caracterização de dsRNAs presentes em diferentes isolados, a análise da transmissão vertical e a obtenção de linhagens isogênicas por meio da cura de vírus. dsRNAs foram detectados em 31 dos 49 isolados de P. griseola analisados. Neste trabalho, a maioria dos isolados apresentou múltiplos fragmentos de dsRNA, que variaram de zero a 10, com tamanhos estimados entre 0,8 e 4,8 kb. O fragmento de dsRNA de 4,8 kb do isolado 29-3 foi eficientemente transmitido para os esporos assexuais. Entretanto, nem todos os fragmentos de dsRNA, entre um e seis, presentes no isolado Ig848 foram transmitidos para colônias monospóricas. Cicloheximida foi utilizada em concentração de 20 μg/mL a fim de obter a cura de micovírus. Para o isolado 29-3, este tratamento foi ineficaz, pois as três colônias repicadas em cicloheximida durante quatro gerações apresentaram o mesmo perfil de ácidos nucléicos totais presente no isolado selvagem. No caso do isolado Ig848, este mesmo tratamento eliminou os fragmentos de 2,2; 2,0; 1,8; 1,2 e 1,0 kb das colônias Ch2 e Ch4, após sete repicagens sucessivas em meio contendo cicloheximida. Diversos fungos fitopatogênicos são acometidos por infecções virais, sendo que essa variação no perfil de ácidos nucléicos presente nos isolados de P. griseola também é observada em outros patógenos de plantas. A presença de múltiplos fragmentos, em um único isolado, pode ser devido à infecção por vírus com genoma segmentado, RNA satélite, RNA defectivo ou infecções mistas. A eficiência de transmissão por meio dos conídios é variável, dependendo da espécie de fungo considerada, mas geralmente é próxima a 100%, conforme ocorreu para o isolado 29-3 de P. griseola. Tanto a cura de alguns fragmentos de dsRNA quanto a perda espontânea durante a conidiogênese, observada para o isolado Ig848, indicam a infecção por replicons independentes. Estas linhagens isogênicas, com e sem alguns fragmentos de dsRNA, terão o efeito da infecção viral avaliados em aspectos como a taxa de esporulação, o crescimento e a patogenicidade. A caracterização destes vírus, presentes em P. griseola, permitirá estudos posteriores sobre o uso destes no controle biológico da mancha-angular, o que poderá reduzir as perdas econômicas causadas por essa doença na lavoura.Item Isolamento e caracterização dos genes que codificam malato sintase e o repressor Nrg1 em Crinipellis perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao)(Universidade Federal de Viçosa, 2006-07-28) Medina, Pilar Ximena Lizarazo; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Cordeiro, Vanessa Kava; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4762990D6; Moraes, Célia Alencar de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781007D6Os genes que codificam o repressor catabólico Nrg1 e a enzima malato sintase de Crinipellis perniciosa foram clonados e caracterizados. A região codificadora do gene nrg1 possui 2121 pb e é interrompida por um íntron de 60 pb posicionado a partir da análise da seqüência de cDNA. Análises por hibridização do DNA total mostraram que o gene está presente em cópia única no genoma do fungo. A proteína deduzida apresenta dois dedos de zinco característicos de proteínas Nrg e possui 256 aminoácidos. A região 5 terminal foi seqüenciada e um potencial cis-elemento para a ligação da proteína reguladora PACC foi identificado. Foram também detectados os cis-elementos TATA box e CAAT box. A regulação da transcrição foi avaliada pela técnica de RT-PCR. O gene foi diferencialmente regulado de acordo com a concentração de glicose. A transcrição de nrg1 foi 2,1 vezes maior no micélio crescido em meio contendo glicose 0,1% do que no meio com glicose 3,0%. Em outra fonte de carbono como glicerol a transcrição foi 4,6 vezes maior do que à reportada em glicose 3,0%. A avaliação da transcrição em relação ao pH indicou uma maior transcrição em pH baixo (pH 2 e 3) do que em pH 4, 6,8 e 8. Esses resultados podem ser explicados pela presença de sítios para a proteína reguladora PacC, que é responsável pela regulação em resposta ao pH. Este é o primeiro relato da presença da proteína repressora Nrg1 em fungos filamentosos. O segundo gene estudado neste trabalho codifica a enzima malato sintase em C. perniciosa. O gene possui 1888 pb e é interrompido por cinco íntrons. Uma proteína de 539 resíduos de aminoácidos foi obtida da tradução deste gene e apresenta a seqüência característica [KR]-[DENQ]-HX(2)-G-L-N-X-W-D-Y-[LIVM]-F. Na região 5 terminal do gene malato sintase foi localizado um possível TATA box e dois possíveis sítios CAAT. A hibridização do DNA de isolados de C. perniciosa dos grupos C1, C2, C3 e C9, com o gene malato sintase, mostrou que este está presente em cópia única no genoma. Interessantemente, esta hibridização permitiu separar os isolados em dois grupos. Nos isolados C1 e C3, que foram coletados na Bahia e no Amazonas, o fragmento hibridizado possui aproximadamente 5.0 kb, mas nos isolados C2 e C9, que foram provenientes da Bahia e do Pará, corresponde a um fragmento de 4,5 kb. A transcrição do gene malato sintase foi analisada pela técnica RTPCR. A transcrição do gene foi analisada após o crescimento do micélio durante 8 dias a 27 ºC, depois este foi lavado e transferido para meio mínimo contendo acetato, isocitrato, glioxilato na presença e ausência de glicose, onde permaneceu 12 ou 24 horas. Foi observada ausência de repressão catabólica. Neste estudo também foi evidenciada a transcrição do gene malato sintase em glicerol e em extrato de polpa de cacau. O isolamento e caracterização dos genes que codificam a malato sintase e a proteína reguladora Nrg1 em C. perniciosa, junto com a disponibilidade de um sistema de transformação, permitiram a obtenção de mutantes para evidenciar os papeis das proteínas na patogenicidade.Item Isolamento, caracterização e regulação de genes que codificam pectato liase em Crinipellis perniciosa, agente etiológico da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao)(Universidade Federal de Viçosa, 2006-04-10) Santos, Jildete Karla dos; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4769955Y3; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Barreto, Robert Weingart; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783300H6; Azevedo, João Lúcio de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4793677J6; Costa, Maurício Dutra; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728228J5Neste trabalho, genes que codificam a enzima pectinolítica pectato liase foram isolados do genoma do fungo Crinipellis perniciosa, agente etiológico da doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro. Enzimas pectinolíticas vêm sendo correlacionadas com a patogenicidade de alguns fungos fitopatogênicos. Buscas preliminares realizadas no Banco de Dados do Projeto Genoma Vassoura de Bruxa , revelaram a presença de seqüências, no genoma de C. perniciosa, com similaridade à pectato liases de diferentes fungos. Duas seqüências, com similaridade com a pectato liase A de Aspergillus niger e a pectato liase D de Fusarium solani f. sp. pisi, foram utilizadas para a construção de oligonucleotídeos específicos. Os fragmentos de DNA amplificados foram utilizados como sondas homológas na determinação do número de cópias destes genes no genoma de C. perniciosa e no isolamento de genes que codificam pectato liase em um Banco Genômico de C. perniciosa, construído no bacteriófago λEMBL3. Análise de hibridização com DNA total de C. perniciosa, clivado com as enzimas BamHI, EcoRI e XbaI, revelaram a presença de, pelo menos, 2 cópias do gene que codifica pectato liase com similaridade à pectato liase A de A. niger e uma cópia do gene que codifica pectato liase com similaridade à pectato liase D de F. solani f. sp. pisi. Com base nesta caracterização inicial três genes, pec1A, pec1B e pec2, foram isolados no Banco Genômico de C. perniciosa e caracterizados. Os genes pec1A e pec1B possuem, respectivamente, regiões codificadoras de 1141 e 1346 pb e são ambas interrompidas por 7 íntrons. O gene pec2 possui uma região codificadora de 936 pb e está interrompida por apenas 3 íntrons. A completa análise dos promotores não foi possível, entretanto, alguns ciselementos envolvidos na regulação de genes puderam ser identificados em pec1B e pec2. As proteínas codificadas por pec1A, pec1B e pec2 possuem respectivamente, 244, 307 e 253 aminoácidos. As proteínas PEL1A, PEL1B apresentaram 60% identidade entre si, mas baixa identidade, 4,3 e 4,6%, respectivamente, com PEC2. Quando comparadas com outras pectato liases de fungos, PEC1A E PEC1B apresentaram maior identidade com pectato liase A de A. niger e A. fumigatus. A enzima PEC2, por sua vez apresentou maior identidade com proteínas de um novo grupo de pectato liases, representado pela família multigênica que codificam pectato liases em F. solani. f. pisi. Alinhamentos múltiplos entre as pectato liases de C. perniciosa e de diferentes fungos fitopatogênicos, bem como a análise filogenética realizada, sugerem que PEC2 realmente pertence a uma nova classe de pectato liase, juntamente com as pectato liases de F. solani f.sp. pisi. Os genes pec1A e pec1B foram expressos em todas as fontes de carbono avaliadas, como em pectina, pectina e glicose, glicose e polpa de cacau, bem como em pectina em pH 4,0, 6,8 e 8,0. Entretanto, diferenças no nível de expressão destes genes foram detectadas, como a maior expressão dos genes pec1A e pec1B em valores de pH igual à 8,0. Já pec2 não foi expresso em nenhuma das condições avaliadas. A maior atividade enzimática detectada no extrato de proteínas do micélio, juntamente com a observação de que os genes que codificam pectato liase de C. perniciosa não respondem à repressão catabólica, sugerem que algumas destas enzimas podem estar ligadas à parede celular e, assim, sujeitas a um controle pós-traducional. Este é o primeiro relato do isolamento e caracterização de genes que codificam pectato liase em basidiomicetos.Item A pectato liase codificada pelo gene pecCl1 é importante para agressividade de Colletotrichum lindemuthianum(Universidade Federal de Viçosa, 2012-07-20) Fassoni, Andréia Cnossen; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://lattes.cnpq.br/7439395633524755; Brommonschenkel, Sérgio Hermínio; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780948Y4; Teixeira, Janaina Aparecida; http://lattes.cnpq.br/7776451670494630Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose do feijoeiro comum. Genes que codificam enzimas que degradam a parede celular são essenciais para o desenvolvimento dessa doença. As pectinases são caracterizadas como o grupo de enzimas que hidrolisam a parede celular mais importante produzidas por fungos fitopatogênicos. O gene pecCl1, que codifica pectato liase, foi previamente identificado em uma biblioteca subtrativa supressiva de feijoeiro infectado com C. lindemuthianum. O isolamento do gene tornou possível a obtenção de mutantes e análise da regulação deste gene durante o desenvolvimento da antracnose, visando determinar se a pectato liase é um fator de patogenicidade. Desta forma, o objetivo do nosso trabalho foi caracterizar estruturalmente e funcionalmente o gene que codifica pectato liase em C. lindemuthianum. Inicialmente, foi realizada a análise estrutural do gene pecCl1. A sequência completa de nucleotídeos do gene pecCl1 foi deposita no Genbank com número de acesso JX270683. A análise da região promotora revelou alguns possíveis cis-elementos e sítios de ligação a fatores de transcrição envolvidos na regulação da expressão gênica da pectato liase. A sequência de aminoácidos deduzida de pecCl1 apresentou identidade de sequências com a pectato liase F de Colletotrichum higginsianum e a pectato liase C de Glomerella graminicola M1.001. Além disso, detectou-se um possível domínio conservado pfam03211 da superfamília de pectato liases. O gene pecCl1 encontra-se representado por uma cópia única no genoma de C. lindemuthianum. No entanto, no genoma de Colletotrichum graminicola, três sequências que codificam pectato liase apresentaram identidade de sequências com o gene pecCl1 de C. lindemuthianum, e no genoma de C. higginsianum sete sequências que codificam pectato liase apresentaram identidade de sequências com o gene pecCl1 de C. lindemuthianum, indicando que o genoma de C. lindemuthianum pode possuir além do gene pecCl1 outros genes que codificam pectato liase. A análise filogenética de sequências de aminoácidos de pectato liases de fungos filamentosos mostrou a formação de dois grupos distintos, que se agruparam com base nos membros da família multigênica de pectato liases. A técnica de Split-Marker mostrou-se eficiente na inativação do gene pecCl1 de C. lindemuthianum, possibilitando o estudo da função do gene pecCl1, em um mutante com integração específica e livre de integrações ectópicas. A inativação do gene pecCl1 não levou a perda completa da atividade de pectato liase, e consequentemente, somente diminuiu os sintomas de antracnose em seu hospedeiro, o que é consistente com a presença de outros genes que codificam pectato liase no fungo, permitindo ao patógeno uma maior flexibilidade em sua agressividade. Foi realizada a análise da expressão diferencial do gene pecCl1 por qPCR nos diferentes estágios de infecção no feijoeiro e foram observados transcritos de pecCl1 em todas as fases de desenvolvimento do fungo na planta, mas houve um aumento significativo destes transcritos cinco dias após a infecção, no início da fase necrotrófica do fungo. Nesta fase, as hifas secundárias causam degradação extensiva da parede celular vegetal por meio da secreção de vasta gama de despolimerases, dentre estas, a pectato liase. Portanto, a pectato liase codificada pelo gene pecCl1 é importante para agressividade de C. lindemuthianum. A análise de pectato liases poderá não somente auxiliar na compreensão da antracnose em feijoeiro comum, mas também poderá levar a descoberta de mais um alvo para o controle dessa doença.Item Retrotransposon LTR no genoma de Moniliophthora perniciosa e Cochliobolus heterostrophus(Universidade Federal de Viçosa, 2009-07-24) Santana, Mateus Ferreira; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Mizubuti, Eduardo Seiti Gomide; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785633J8; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://lattes.cnpq.br/1245825021506199; Moraes, Célia Alencar de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781007D6; Costa, Maurício Dutra; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728228J5Retrotransposons do grupo Gypsy/Ty3 são os principais elementos transponíveis encontrados no genoma de fungos fitopatogênicos. Neste trabalho, dois retrotransposons denominados de MpSaci e Sophie foram analisados em Moniliophthora perniciosa e Cochliobolus heterostrophus, respectivamente. MpSaci foi utilizado para avaliar os marcadores moleculares baseados em elementos transponíveis IRAP e REMAP. Quando 70 isolados de M. perniciosa foram analisados, o total de 43 locos foram amplificados gerando 46,51% de bandas polimórficas. Diferenças significativas foram encontradas entre as populações de M. perniciosas divididas em relação ao biótipo e à origem geográfica, demonstrando que as populações encontram-se estruturadas quanto à origem geográfica e ao hospedeiro (biótipo). Pela análise de agrupamento de diferentes regiões geográficas do biótipo C foram observados dois grandes grupos que evidenciam duas principais entradas do patógeno no estado da Bahia. Buscas feitas no banco de dados do Projeto Genoma de C. heterostrophus (JGI - Genome) revelaram a presença de seqüências de DNA com similaridade a transcriptase reversa de elementos da Classe I pertencentes ao grupo Gypsy/Ty3. Com base nessas seqüências foi possível encontrar sete cópias diferentes e intactas de um elemento transponível que foi denominado Sophie. A análise de 37 seqüências do gene da transcriptase reversa demonstrou possível mecanismo de silenciamento semelhante a RIP. As sete cópias do elemento Sophie apresentaram 7.426 pb a 7.512 pb. O retrotransposon Sophie possui duas seqüências de leitura abertas (ORFs) que codificam a proteína Gag e a poliproteína Pol. A presença de diferentes sítios-alvo sugere que Sophie é um elemento com atividade recente no genoma de C. heterostrophus podendo ter grande impacto na evolução do genoma do seu hospedeiro.Item Use of the IRAP marker to study genetic variability in Pseudocercospora fijiensis populations(Universidade Federal de Viçosa, 2013-03-22) Queiroz, Casley Borges de; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Mizubuti, Eduardo Seiti Gomide; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785633J8; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; http://lattes.cnpq.br/0922107268691629; Ribon, Andréa de Oliveira Barros; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026E6Devido à ausência de estudo de caracterização da variabilidade genética das populações de Pseudocercospora fijiensis recentemente introduzidas no Brasil, o objetivo desse trabalho foi avaliar a adequabilidade do marcador IRAP para estudar variações genéticas entre indivíduos, bem como determinar a estrutura genética da população brasileira de P. fijiensis com base no fingerprinting gerado por amplificação de polimorfismo entre retrotransposons (IRAP). Um total de 22 locos foi amplificado, sendo 77.3 % polimórficos. A análise de agrupamento revelou dois principais grupos no Brasil. A diversidade gênica (HE) foi de 0.22 e pela análise de variância molecular verificou-se que a maior variabilidade genética está dentro das populações. A Análise Discriminante de Componente Principal (DAPC) revelou que não há nenhuma estruturação relacionada com as origens geográficas e cultiva hospedeiro. O sistema de marcador baseado em retrotransposon IRAP é ferramenta apropriada para estudar a variabilidade genética em P. fijiensis.