Microbiologia Agrícola
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Item Cinética de crescimento e longevidade de culturas de Kluyveromyces lactis sob estresse por nitrogênio(Universidade Federal de Viçosa, 2007-03-16) Correa, Lygia Fátima da Mata; Nascimento, Antonio Galvão do; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4797432E8; Viloria, Marlene Isabel Vargas; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781964E6; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/5827690873017201; Passos, Frederico José Vieira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781218J9; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8Para investigar o estresse imposto por condições limitantes de nitrogênio na cinética de crescimento e na longevidade de culturas de Kluyveromyces lactis, determinaram-se as constantes cinéticas do crescimento de culturas de K. lactis em função da concentração de sulfato de amônio, avaliou-se o efeito da idade das culturas na velocidade específica inicial de crescimento e averiguaram-se os sinais de envelhecimento celular em função de diferentes velocidades de crescimento de culturas conduzidas em regime contínuo sob limitação por nitrogênio. Culturas de K. lactis foram cultivadas em meio YCB tamponado acrescido de sulfato de amônio, nas concentrações 0,02 a 38,0 mmol.L-1. A cinética de crescimento de K. lactis em função da concentração de sulfato de amônio, obedeceu o modelo cinético proposto por Monod. A velocidade específica máxima de crescimento (μmáx.) e a constante de saturação (Ks) foram de 0,44 h-1 e 0,15 mmol.L-1, respectivamente. A velocidade específica inicial de crescimento reduziu com a idade da cultura. Concentrações de quitina na parede celular aumentaram com a idade da cultura e com a concentração de sulfato de amônio. Dimensões celulares aumentaram com a idade independente da concentração de sulfato de amônio. A presença de características morfológicas de apoptose foi verificada a partir do quinto dia de transferência da cultura para meio novo nas concentrações de 0,57 mmol.L-1, 3,80 mmol.L-1, 7,60 mmol.L-1 e a partir do oitavo dia de repicagem na concentração de 38,0 mmol.L-1 de [NH4]2SO4. Culturas contínuas sob estresse por nitrogênio foram conduzidas nas velocidades de crescimento de 0,01, 0,06; 0,18 e 0,35 h-1. Culturas com velocidades de crescimento de 0,18 e 0,35 h-1 produziram maior rendimento em etanol e menor rendimento em glicerol. A concentração de quitina na parede celular de culturas de K. lactis conduzidas nas velocidades de crescimento de 0,01 h-1 e 0,06 h-1 foi maior (27 mg.mL-1 e 20 mg.mL-1 de N-acetilglicosamina) comparada com as culturas conduzidas nas velocidades de crescimento de 0,18 h-1 e 0,35 h-1, que apresentaram 6 μg.mL-1 e 5 μg.mL-1 de N-acetilglicosamina, respectivamente. As dimensões das células de K. lactis foram maiores na cultura conduzida com velocidade de crescimento de 0,01 h-1, se comparada com as demais velocidades de crescimento avaliadas: 0,06; 0,18 e 0,35 h-1. Apesar desses sinais de envelhecimento terem sido detectados, características morfológicas de apoptose só foram identificadas nas culturas de K. lactis conduzidas na velocidade de crescimento de 0,01 h-1. Os resultados mostraram que o estresse por nitrogênio e a idade afetam a cinética de crescimento de culturas de K. lactis e sugerem que culturas contínuas de Kluyveromyces lactis sob condições nitrogênio limitantes conduzidas com velocidade de crescimento correspondente a 0,01 h-1 podem ser úteis em estudos sobre sinais de envelhecimento celular.Item Cinética de crescimento e metabolismo de levedura potencialmente probiótica(Universidade Federal de Viçosa, 2003-07-21) Cangusu, Alex Sander Rodrigues; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4778644U8; Alves, Virgínia Maria Chaves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781053Z0; Moraes, Célia Alencar de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781007D6; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; Passos, Frederico José Vieira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781218J9A cinética de crescimento e metabolismo da levedura UFV-3 isolada da microbiota intestinal de leitões recém-nascidos foi estudada na perspectiva de sua utilização como probiótico. As principais condições de cultivo foram sugeridas em meio YPD. Temperatura e pH foram investigados na faixa de 28 45 ºC e 3.8 5.5. A levedura UFV-3 apresentou pH ótimo de crescimento de 4.7 e temperatura de 40 ºC. A cinética de crescimento foi avaliada em três níveis de aeração: aerobiose, microaerobiose e anaerobiose. O coeficiente de rendimento celular foi de 0.03 g.mmol-1, 0.02g.mmol-1 e 0.01g.mmol-1 nas condições de aerobiose, microaerobiose e anaerobiose respectivamente. Os efeitos dos níveis de aeração no metabolismo oxido-redutivo foram analisados pela produção de etanol, glicerol e ácidos orgânicos. A concentração final de etanol alcançou 120 mmol.L-1, 174,03 mmol.L-1 e 101 mmol.L-1 para as condições de aerobiose, microaerobiose e anaerobiose respectivamente. O coeficiente de rendimento de produto da conversão de glicose em etanol foram 1.1 mmol.mmol-1, 1.6 mmol.mmol-1 e 1.7 mmol.mmol-1 para as respectivas condições de aerobiose, microaerobiose e anaerobiose. Glicerol foi produzido em concentrações de 11 mmol.L-1, 10mmol.L-1 e 7 mmol.L-1 nas condições de aerobiose, microaerobiose e anaerobiose respectivamente. O coeficiente de rendimento de produto da conversão de glicose em glicerol foram 0.10 mmol.mmol-1, 0.09 mmol.mmol-1 e 0.11 mmol.mmol-1 para as respectivas condições de aerobiose, microaerobiose e anaerobiose. Traços de concentrações de metabólitos como ácido propiônico, acido lático, e acido succínico foram detectados. Ácido acético não foi detectado em nenhum dos níveis de aeração estudados.Item Cinética de crescimento, características bioquímico-morfológicas de envelhecimento e perfil metabólico de culturas contínuas de Kluyveromyces lactis sob limitação por nitrogênio(Universidade Federal de Viçosa, 2011-05-31) Correa, Lygia Fátima da Mata; Viloria, Marlene Isabel Vargas; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781964E6; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783874H3; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/5827690873017201; Passos, Frederico José Vieira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781218J9; Williams, Thomas Christopher Rhys; http://lattes.cnpq.br/3232721185279491; Martins Filho, Olindo Assis; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785619H4Para investigar o envelhecimento de culturas contínuas de Kluyveromyces lactis, sob limitação nutricional por nitrogênio, visando à identificação de sinais extracelulares que desencadeiam tal processo ou em resposta às condições limitantes do meio, culturas de K. lactis foram fisiologicamente caracterizadas sob diferentes níveis de limitação por nitrogênio. As condições fisiológicas de crescimento e de limitação por nitrogênio para as culturas contínuas de K. lactis foram estabelecidas em meio YCB suplementado com sulfato de amônio (μmáx. = 0,40 h-1 e Ks = 0,091 mM), tamponado com tampão fosfato (pH 5,5 - 6,0) e com fluxo de alimentação, que resultasse em velocidades de crescimento de 0,01 a 0,2 h-1, correspondendo à limitação por nitrogênio. Sob as menores velocidades de crescimento, as culturas de K. lactis, em regime permanente, apresentaram maior tempo de geração, tempo de residência, produção de biomassa e de proteínas extracelulares. Além disso, as populações de células das culturas de K. lactis, sob as menores velocidades de crescimento apresentaram menor viabilidade, maior porcentagem de cicatrizes, maior concentração de N-acetilglicosamina, maior acúmulo de ROS, maior porcentagem de apoptose por externalização da fosfatidilserina e fragmentação do DNA, maior dimensão celular, maior produção de triptofol, feniletanol e menor produção de etanol e glicerol, sugerindo que culturas contínuas de K. lactis, sob baixas velocidades de crescimento, sejam favoráveis para o estudo da fisiologia do processo de envelhecimento de leveduras. O perfil metabólico extracelular das culturas de K. lactis permitiu constatar 19 fragmentos de metabólitos diferentes, por LC-MS. Nas menores velocidades de crescimento, os fragmentos 299, 321, 349, 485, 507, 543, 583 e 756 foram menos abundantes, enquanto os fragmentos 432, 656 e 714 foram mais abundantes. O agrupamento hierárquico dos fragmentos permitiu constatar 7 grupos constituídos por diferentes fragmentos (m/z) e o agrupamento dos tratamentos possibilitou a obtenção de 3 grupos. Porém, não foi possível realizar a correlação dos fragmentos dos metabólitos detectados com o envelhecimento celular de K. lactis ou com a própria condição de limitação por nitrogênio, uma vez que a identificação desses metabólitos extracelulares não foi concluída. Por GC-MS, foram identificados 28 metabólitos extracelulares (aminoácidos, ácidos orgânicos e ácidos graxos) secretados pelas culturas de K. lactis. Alguns metabólitos foram diferencialmente mais abundantes nas menores velocidades de crescimento, enquanto outros foram mais abundantes nas maiores velocidades de crescimento. Diferentes vias metabólicas foram relacionadas com a produção dos metabólitos extracelulares identificados, porém uma análise mais minuciosa deve ser feita no sentido de correlacionálas com possíveis sinais extracelulares que possam desencadear o processo de envelhecimento ou que possam estar envolvidos com as condições limitantes do meio.Item Condições fisiológicas e ambientais que favorecem a produção de carotenoides por Rhodotorula mucilaginosa(Universidade Federal de Viçosa, 2013-10-22) Yuyama, Kamila Tomoko; Nascimento, Antonio Galvão do; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4797432E8; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783874H3; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/3560544474696690; Castro, Vanessa Cristina de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4779983T2Em micro-organismos produtores, carotenoides são pigmentos, precursores de vitamina A, que os protegem contra o estresse oxidativo. Fatores ambientais extrínsecos tais como temperatura, fontes específicas de carbono e indutores de espécies reativas de oxigênio (ROS) como luz e peróxido de hidrogênio associados a condições fisiológicas (fase de crescimento exponencial máxima, fase estacionária inicial e tardia) influenciam no acúmulo de carotenoides pelas células microbianas. Uma levedura pigmentada foi isolada do horto da Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, Brasil. Os objetivos desse trabalho foram identificar esta levedura isolada no horto da UFV e analisar a influência dos fatores ambientais (temperatura, intensidade de luz e concentração de arabinose) e das diferentes condições fisiológicas (fase log, estacionária inicial e tardia) na produção de carotenoides e na velocidade de crescimento da levedura. A identificação taxonômica da levedura foi feita pelo Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) por meio das análises das sequências 5,8S e 26S do rRNA e por ferramentas moleculares e bioquímicas, resultando na identificação da espécie como Rhodotorula mucilaginosa. A influência das condições ambientais e fisiológicas na produção de carotenoides e na taxa de crescimento foi verificada pela metodologia de superfície de resposta (RSM) por meio de um delineamento composto central (CCD) com três fatores e seis replicatas do ponto central. Os 20 experimentos foram feitos em 91h de batelada e as amostras foram coletadas em diferentes estados fisiológicos da cultura, isto é na fase de crescimento máximo (fase log), fase de desaceleração do crescimento (2h iniciais na entrada da fase estacionária) e fase estacionária (60h após alcançar a massa celular máxima). Demonstrou-se que a formação de carotenoides pela levedura não é associada ao crescimento. O rendimento máximo de carotenoides por massa celular (μg/g) ocorreu na fase de desaceleração do crescimento. A velocidade específica máxima de crescimento (μmax) e o rendimento em carotenóide total por massa celular (μg/g) foram ajustados ao modelo matemático, com R2 de 0,96 e 0,91 respectivamente, e o desajuste não foi significante (p>0,05). Os níveis de intensidade de luz (μmol m-2s-1), arabinose (%p/v) e temperatura (°C) que criaram a resposta máxima de rendimento de carotenóides totais (93,92 μg/g) foram 100 μmol m-2s-1; 5%; 18 °C e da velocidade de crescimento (0,31h-1) foram 63,6 μmol m-2s-1; 3,7% e 24,6 °C.Item Condições fisiológicas que favorecem a síntese de ácido L-ascórbico (vitamina C) por culturas de Kluyveromyces lactis metabolicamente engenheirada(Universidade Federal de Viçosa, 2014-02-17) Alvim, Mariana Caroline Tocantins; Passos, Frederico José Vieira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781218J9; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/7361036485940798; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/7578520372524430; Rosa, Júlio César Câmara; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4716126E0O ácido L-ascórbico (ALA) é produzido naturalmente por plantas a partir de D-glicose. Leveduras sintetizam um metabólito semelhante, o ácido D-eritroascórbico (ADEA). Embora este composto não mostre atividade contra o escorbuto, ele contém uma função antioxidante, mas é produzido pelo micro-organismo em baixas concentrações. Recentemente, com a finalidade de fazer as leveduras serem capazes de converter o componente D-galactose da D-lactose do soro de queijo em ALA, a linhagem selvagem de Kluyveromyces lactis CBS2359 foi transformada com genes, que integram a via de biossíntese de L-galactose, isolados de Arabidopsis thaliana. Na presença do intermediário L-galactose, ALA pode então ser sintetizado pela levedura com as enzimas responsáveis pela produção de ADEA. Foi demonstrado que a linhagem engenheirada JVC 1-56 foi capaz de sintetizar ALA em comparação com a selvagem, mas com baixo rendimento. Neste sentido, estudos que auxiliem o aumento da produção de ALA são relevantes. Uma vez que a via engenheirada da síntese de ALA e a via nativa da formação da parede celular de K. lactis possuem um intermediário comum, GDP-D-manose, faz-se necessário avaliar o efeito do desacoplamento da produção de ALA do crescimento que requer constante síntese da parede. Além disso, considerando a propriedade antioxidante do ALA, a expectativa é de que a produção deste metabólito aumentasse quando JVC 1-56 fosse exposta a uma condição de estresse oxidativo por menadiona. Neste contexto, este trabalho investigou as condições fisiológicas mencionadas utilizando os meios Yeast Galactose Base (YGB) e soro de queijo ultrafiltrado (SQU - subproduto de indústrias de queijo em que predomina lactose como fonte de carbono). Foi averiguado que Kluyveromyces lactis JVC 1-56 produz ALA com rendimentos maiores quando cultivada por 96 horas em batelada no meio YPGal. O cultivo em baixas velocidades de crescimento (0,04 h -1) predispõe as células a sintetizar mais ALA por unidade de massa celular (0,80 mg/mg). Entretanto, o rendimento da cultura contínua operada como quimostato, tendo nitrogênio como substrato limitante, ainda mostrou ser inferior ao previsto na batelada (1,94 mg/mg). Já o estresse oxidativo por 12,5 μM de menadiona sobre K. lactis JVC1- 56, nas condições aplicadas, não foi eficaz no aumento da produção de ALA (1,47 mg/mg). Ainda, o rendimento de ADEA foi superior ao de ALA nas duas estratégias: 1,37 mg/mg a 0,21 h-1 na cultura sob regime permanente, 8,52 mg/mg na batelada sob estresse oxidativo e 10,33 mg/mg na batelada na ausência do agente oxidante, indicando que ele pode estar em uma configuração mais estável do que a vitamina C. Finalmente, o permeado do soro de queijo continua sendo uma perspectiva para a conversão da lactose em um produto biotecnológico de maior valor agregado.Item Construção de linhagens de Kluyveromyces lactis Δku80 hospedeiras para produção de proteínas recombinantes: Análise da expressão da fusão estreptavidina-pectina liase(Universidade Federal de Viçosa, 2011-02-15) Colombo, Lívia Tavares; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/4745874654946687; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/7361036485940798; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0A recombinação homóloga em Kluyveromyces lactis não é a via preferencial usada como mecanismo de reparo de quebra de fita dupla de DNA, o que pode ser indesejado em construções de expressão de proteínas dependentes de integração gene-específico. Para obter linhagens de K. lactis hospedeiras para a expressão de proteínas recombinantes eficientes na via de recombinação homóloga realizou-se a mutação do gene KU80. Este gene é essencial para perfeito funcionamento da via de junções de extremidades não-homólogas (NHEJ), responsável pela integração aleatória do DNA exógeno no genoma hospedeiro. A deleção do gene KU80 foi feita utilizando a técnica Split-Marker. Dois fragmentos foram obtidos por fusão por PCR, cada um contendo uma sequência flanqueadora da região codificante do gene KU80 (extremidades 5 e 3 ) e uma parte do gene de resistência a geneticina (KanMX). O cassete de deleção resultante da recombinação in vivo dos dois fragmentos gerados continha o gene KanMX flanqueado pelas extremidades da região codificante do gene KU80, e foi utilizado para deleção do gene KU80 por recombinação homóloga no genoma de duas linhagens de K. lactis, JA6 e HP108. O fragmento de 3,7 Kb obtido por amplificação por PCR com oligonucleotídeos externos à região codificante do gene KU80 confirmou a integração do cassete de deleção no gene alvo. A eficiência de integração com os fragmentos resultantes do Split-Marker foi de 100 %. Os vetores pKLAC1, e pKLAC1/cStp contendo o domínio de afinidade da estreptavidina pela biotina, foram usados para determinar a eficiência de recombinação homóloga das linhagens mutantes KU80 (JA6ΔKU80 e HP108ΔKU80). O gene da pectina liase (plg1) de Penicillium griseoroseum foi clonado nesses vetores para avaliar a capacidade de linhagens de K. lactis em produzir e secretar a proteína recombinante. A eficiência de transformação (transformantes/μg de DNA) dos mutantes JA6ΔKU80 e HP108ΔKU80 com os vetores pKLAC1/Plg1 e pKLAC1/cStp-Plg1, foi superior à das linhagens parentais JA6 e HP108. A eficiência de integração no gene alvo foi de 100% para maioria das linhagens, com exceção das linhagens JA6/Plg1e HP108ΔKU80/Plg1 que apresentaram, respectivamente, eficiência de 80 e 70 % de integração geneespecífico. Apesar da eficiência de integração por recombinação homóloga, não houve secreção de PL e da fusão cStp-Plg1 como esperado ao se utilizar o vetor pKLAC1. A atividade intracelular de pectina liase (PL) só foi significativa em relação à parental para a cepa HP108/Plg1, que demonstrou atividade específica de 9,525 U.mg-1 proteína.Item Influência de KlRox1p no metabolismo fermentativo de Kluyveromyces lactis(Universidade Federal de Viçosa, 2009-02-16) Harami, Talita; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4750606T5; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783874H3; Ramos, Juliana Rocha Lopes Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790613J3Esse trabalho é uma contribuição aos estudos sobre a função de KlRox1p no metabolismo fermentativo de Kluyveromyces lactis. Rox1p é conhecida em Saccharomyces cerevisiae por reprimir, em aerobiose, genes que são expressos em condição limitante de oxigênio. A cinética de crescimento de linhagens de Kluyveromyces lactis MW270-7B e sua mutante derivativa K. lactis MW270-7B rox1Δ foi realizada em meio YNB (Yeast Nitrogen Base) contendo fontes de carbono fermentáveis (glicose e lactose) ou não fermentáveis (glicerol e etanol) para determinar o perfil de crescimento nessas fontes. Além disso, ambas as linhagens tiveram sua capacidade fermentativa avaliada na presença de um inibidor da cadeia transportadora de elétrons, antimicina A, em meio YPD (extrato de levedura, peptona e glicose). Os resultados indicaram que a ausência de KlROX1 não favoreceu o crescimento em fontes de carbono fermentáveis, mas favoreceu em fontes de carbono não fermentáveis. A maior capacidade fermentativa de K. lactis rox1Δ foi confirmada pelo maior rendimento de etanol por biomassa detectada, na ausência e presença de antimicina A (10 e 20 µM). As linhagens mutante rox1 e controle também foram cultivadas em YNB e glicose em regime contínuo (D= 0,1h-1) sob aerobiose e, em seguida, submetidas à hipoxia por 9 horas. Amostras foram coletadas a cada 3 horas para análise da expressão de possíveis genes alvos de KlRox1p, bem como de etanol e da atividade da álcool desidrogenase (ADH). Para análise da expressão gênica, sequências de reconhecimento por KlRox1p foram pesquisadas in silico nos promotores dos genes KlAAC3, KlCOX5B, KlHEM13, KlHAP1, KlRAG1 e KlADH1 e foram encontradas divergindo de dois nucleotídeos da sequência consenso YYYATTGTTCTC. KlRox1p mostrou ter efeito negativo sobre as expressões de KlAAC3 e KlHEM13 em aerobiose, mas não pareceu atuar sobre KlCOX5B. A concentração de etanol, a atividade da ADH e a expressão de KlADH1 evidenciaram o metabolismo mais fermentativo de K. lactis rox1Δ tanto em aerobiose quanto em hipoxia. E, por um mecanismo ainda desconhecido, KlRox1p atuou sobre as expressões de KlHAP1 e KlRAG1. A influência de KlRox1p na expressão de KlADH1, KlRAG1 e KlHAP1, sugere a participação de KlRox1p no controle de pontos chaves do metabolismo fermentativo: entrada da glicose, que determina o fluxo para a manutenção de uma via fermentativa, bem como na reação redutiva final, que culmina com a formação de etanol. A existência de genes que mostraram ser regulados negativamente por KlRox1p em aerobiose, como KlAAC3 e KlHEM13, indica a existência em K. lactis de mecanismo de regulação transcricional por oxigênio que visa melhor utilizar o oxigênio numa condição limitante, semelhante à função de Rox1p em Saccharomyces cerevisiae. Esse mecanismo, entretanto, parece não estar relacionado apenas com as concentrações de oxigênio, mas também com metabolismo de carbono fermentável ou não fermentável.Item Influência do metabolismo de carbono e do nível de oxigênio sobre a localização da permease de lactose em Kluyveromyces lactis(Universidade Federal de Viçosa, 2007-09-28) Silveira, Wendel Batista da; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/7361036485940798; Costa, Maurício Dutra; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728228J5; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Araújo, Pedro Soares de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780524P3Neste trabalho foi analisada a influência da fonte de carbono e do nível de oxigênio sobre a localização da permease Lac12GFPp na levedura Kluyveromyces lactis. Inicialmente, foi mostrado que K. lactis apresenta afinidade maior para lactose do que para glicose. Os dados indicaram que a localização da permease Lac12GFPp dependente da KlSnf1p não foi afetada pela presença de glicose. A localização dessa permease foi similar quando K. lactis foi cultivada em galactose e glicose, mas diferente quando cultivada em lactose. Os níveis de mRNA do gene LAC12GFP expressos a partir do promotor ADH1, que não está sob a influência da KlSnf1p, foram similares entre a linhagem selvagem e o mutante Klsnf1. Esse resultado mostra que a influência da KlSnf1p sobre a expressão do gene LAC12GFP é exercida marcantemente somente em nível pós-traducional. A análise da localização subcelular da permease de lactose no mutante Klsnf1 evidenciou que a permease é encontrada na membrana do vacúolo, sugerindo que Klsnf1p pode estar envolvida com a translocação da permease para dentro do vacúolo. Em condições hipóxicas, até 3 h de crescimento, foi observado aumento do sinal da permease de lactose na membrana plasmática, em compação com as condições normóxicas. Na tentativa de isolar reguladores negativos do transporte de lactose em K. lactis, realizou-se uma triagem genética (supressão multicópia). A supressão multicópia foi utilizada para selecionar transformantes capazes de suprimir a toxicidade da lactose observada no mutante Kllac4 cultivado em meio mínimo contendo lactose e glicerol como fontes de carbono. Entre os 68 plasmídeos recuperados do mutante Kllac4 transformado com uma biblioteca genômica, nove apresentaram tamanho maior que o do vetor vazio (Kep6). Contudo, os dados deste estudo indicam que a supressão foi devida a uma mutação espontânea. Nesses mutantes, o transporte de lactose não foi prejudicado.Item Lacases de actinobatérias: caracterização, obtenção de novos primers e expressão heteróloga na levedura Kluyveromyces marxianus UFV-3(Universidade Federal de Viçosa, 2014-02-13) Fernandes, Tatiana Alves Rigamonte; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/7361036485940798; Zucchi, Tiago Domingues; http://lattes.cnpq.br/2998333095295038; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/6781518279439266; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Campos, Lúcio Antonio de Oliveira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783908P9; Castro, Rodrigo PiresDentre as enzimas multicobre oxidases, as lacases, por sua grande variedade de substratos, tem atraído atenção tanto para pesquisa básica quanto aplicada a atividades industriais e ambientais. Com relação às lacases de origem microbiana, pouco se conhece sobre aquelas produzidas por bactérias. Neste trabalho, destaca-se o filo Actinobacteria, ordem Actinomycetales, devido à sua reconhecida importância biotecnológica e sua habilidade para degradação de compostos recalcitrantes, sendo muitos deles substratos de lacases. Tendo em vista a demanda por grande volume de enzima por parte das diversas indústrias, e a dificuldade de manipulação dos produtores nativos, é sugerida aqui a expressão heteróloga de lacases de actinobactérias na levedura Kluyveromyces marxianus, em virtude das propriedades industriais que a mesma apresenta, tais como alta velocidade do crescimento, termotolerância e status Generally Regarded as Safe (GRAS). O objetivo deste trabalho foi obter uma linhagem de Kluyveromyces marxianus portando gene de lacase de actinobactéria, capaz de expressá-lo e secretar a enzima ativa; buscando- se, para isso, isolar actinobactérias produtoras de lacase a partir de solo, caracterizar a enzima, isolar um gene de lacase, clonar em vetor de expressão e, por fim, transformar K. marxianus UFV-3. A partir de dados da literatura, realizou-se uma revisão crítica relacionada ao tema, e as sequências gênicas que codificam proteínas caracterizadas foram identificadas e utilizadas na síntese de oligonucleotídeos iniciadores que se revelaram adequados para detecção e isolamento do gene neste grupo, havendo distinção de genes correspondentes a proteínas com duas estruturas distintas. Havendo o isolamento de um dos genes, o mesmo foi clonado em cassete de expressão para integração no genoma da K. marxinus UFV-3; os dados sugerem que houve sucesso na integração.Item Metabolismo de lactose em Kluyveromyces marxianus UFV-3 e Kluyveromyces lactis JA6(Universidade Federal de Viçosa, 2009-02-17) Diniz, Raphael Hermano Santos; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/8014216152065609; Passos, Frederico José Vieira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781218J9; Alves, Virgínia Maria Chaves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781053Z0O metabolismo fermentativo de lactose em Kluyveromyces marxianus UFV-3 foi comparado ao de Kluyveromyces lactis JA6 em aerobiose e hipoxia por meio da análise de cinéticas de crescimento, consumo de substrato, produção de etanol e formação de biomassa, em função da concentração de lactose. Determinou-se ainda a expressão gênica e atividade de enzimas-chave do metabolismo de lactose em aerobiose e hipoxia. Nas fermentações conduzidas em aerobiose e hipoxia em concentrações de lactose de 0,25 a 64 mM, K. marxianus UFV-3 apresentou maior velocidade específica de crescimento e maior concentração de biomassa após 24 horas de cultivo, em relação a K. lactis JA6. Nas fermentações com 64 mM de lactose em aerobiose e hipoxia K. marxianus UFV-3 mostrou maior rendimento de etanol por lactose que K. lactis JA6, demonstrando que alta concentração de substrato favorece metabolismo fermentativo em K. marxianus UFV-3. Sob aerobiose K. marxianus UFV-3 possui maior atividade de piruvato desidrogenase que K. lactis JA6, justificando a maior formação de biomassa e maior velocidade de crescimento verificada em K. marxianus UFV-3 em aerobiose. Sob hipoxia as maiores atividades de β-galactosidase e de piruvato descarboxilase de K. marxianus UFV-3 em relação à K. lactis JA6 parecem ser os fatores que contribuem para a maior formação de etanol de K. marxianus UFV-3 quando comparado a K. lactis JA6. Em hipoxia K. marxianus apresentou maior expressão de genes que codificam enzimas para a via de Leilor, para a enzima β-gal e piruvato descarboxilase quando comparado à aerobiose. Indicando que estes genes são importantes para o metabolismo de lactose em hipoxia. Já em K. lactis JA6 nenhum destes genes apresentou expressão aumentada em hipoxia. Tanto a maior expressão de genes que codificam enzimas chaves do metabolismo de lactose quanto à maior atividade enzimática parecem ser os responsáveis pela capacidade fermentativa de K. marxianus UFV-3.Item Obtenção de inoculante e de coquetel enzimático lignocelulolítico a partir de comunidades microbianas termofílicas(Universidade Federal de Viçosa, 2012-02-17) Souza, Robson de Assis; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; Kasuya, Maria Catarina Megumi; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4721444T5; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/5580102665962863; Guimarães, Valéria Monteze; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4798758T3Três comunidades microbianas lignocelulolíticas e termofílicas foram selecionadas por subcultivo em meio de enriquecimento a 55 °C. Uma comunidade foi selecionada a partir de esterco de gado em compostagem, outra de bagaço de cana em decomposição e a terceira foi obtida a partir da mistura de alíquotas do meio de cultivo das duas anteriores. Tais comunidades apresentavam a característica de decompor uma fita de celulose em três dias de cultivo. Ao se avaliar o dia de máxima atividade CMCase e xilanase em cada comunidade, verificou-se que os melhores resultados foram encontrados no consórcio misto, com atividade de 0,09 U mg-1 para CMCase no segundo dia de cultivo e 2,86 U mg-1 para xilanase no quarto dia. Essas enzimas foram parcialmente caracterizadas em relação à temperatura e pH ótimos de atuação. Verificou-se que CMCase apresentou maior atividade a 60 °C e pH 5,4, e manteve 80% de sua atividade numa faixa de pH de 4,5 a 6,5. Já para a xilanase, a temperatura ótima foi de 65 °C e nessa mesma faixa de pH manteve uma atividade residual de 97%. O extrato livre de células foi concentrado por ultrafiltração e obteve-se um coquetel enzimático com atividade de CMCase e xilanase maior que no extrato bruto cerca de 25 e 55 vezes, respectivamente. O coquetel foi conservado pela adição de 50% de glicerol. Após 60 dias de armazenamento a 4 °C, a xilanase manteve 80% de sua atividade inicial e a CMCase não apresentou perda de atividade quando mantida a 25 °C pelo mesmo período. A massa celular da comunidade mista constitui um inoculante capaz de manter o fenótipo celulolítico após congelamento rápido e armazenamento a - 80 °C por 60 dias. Ensaio em batelada alimentada mostrou que essa comunidade apresenta potencial para ser manipulada a fim de se manter continuamente a expressão de enzimas celulolíticas ao longo do tempo. Os resultados mostraram que foi possível obter um coquetel de enzimas a partir do inoculante, cuja atividade celulolítica tolerou variações de pH e temperatura ótima em torno de 60 °C.Item Obtenção de linhagens de Kluyveromyces lactis recombinantes produtoras de estreptavidina(Universidade Federal de Viçosa, 2007-03-09) Rosa, Júlio César Câmara; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4716126E0; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Nascimento, Antonio Galvão do; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4797432E8A forte interação da proteína estreptavidina pela molécula de biotina constitui um excelente sistema para a separação e/ou imobilização de proteínas e de enzimas de interesse industrial. Com a intenção de produzir proteínas com propriedades de adsorção biosseletiva, nós temos modificado a seqüência do plasmídeo pKLAC1 pela inserção do domínio de afinidade da estreptavidina pela biotina. Utilizando a técnica da Reação da Polimerase em cadeia (PCR), a seqüência de cerca de 355pb foi amplificada a partir do vetor pSTP4 que contém toda seqüência de nucleotídeos referente à proteína estreptavidina. O Fragmento amplificado apresentou 100% de identidade com a seqüência de nucleotídeos da proteína estreptavidina depositada no Gene Bank. O fragmento foi inserido no vetor pKLAC1 nos sítios Xho I e Bgl II em fase com a seqüência do peptídeo sinal do mating-α-factor. O plasmídeo pKLAC1/cStp foi linearizado com enzima Ahd I e foi utilizado para a transformação das linhagens de K. lactis MW 98.8C e CBS 2359. Os transformantes selecionados em meio YCB (Yeast Carbon Base) contendo 5 mM de acetamida como única fonte de nitrogênio e confirmados por PCR foram mitoticamente estáveis. A alta biomassa celular (DO600 = 18) obtida em erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio YPD foi centrifugada e transferida para meio de indução contendo 2% (p/v) de lactose. O sobrenadante das culturas foi analisado qualitativamente para estreptavidina pela técnica de SDS PAGE. As proteínas totais foram determinadas pelo método de BRADFORD utilizando BSA (Albumina Bovina Sérica) como padrão. As amostras foram coletadas a cada 24 horas durante 6 horas de cultivo sob regime de batelada. A atividade da proteína estreptavidina presente no sobrenadante das culturas recombinantes foi determinada pelo teste do reagente HABA. Os meios YPL e YNB contendo 0,5% de extrato de levedura exibiram os melhores resultados quanto à produção extracelular de estreptavidina ativa e de proteínas totais.Item Otimização do processo fermentativo e análise do secretoma de Kluyveromyces marxianus UFV-3 em meios contendo lactose em diferentes condições de cultivo(Universidade Federal de Viçosa, 2013-03-15) Diniz, Raphael Hermano Santos; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/7361036485940798; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/8014216152065609; Santos, Agenor Valadares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4704067Y1; Ribeiro, Cleberson; http://lattes.cnpq.br/5023387764069051; Nascimento, Antonio Galvão do; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4797432E8Kluyveromyces marxianus UFV-3 é uma levedura que possui metabolismo respiro-fermentativo, ou seja, a fermentação e respiração coexistem, contudo a via fermentativa ou respiratória pode ser favorecida dependendo da concentração de oxigênio e carboidrato no meio de cultivo. Considerando esta característica das leveduras do gênero Kluyveromyces o objetivo deste trabalho foi otimizar a produção de etanol a partir de permeado de soro de queijo (PSQ) e caracterizar o secretoma de Kluyveromyces marxianus UFV-3, tendo em vista o uso desta levedura como uma hospedeira para produção de proteínas heterólogas. Para otimizar a produção de etanol em PSQ foi utilizada a metodologia de superfície resposta (MSR) com delineamento composto central rotacionado (DCCR) avaliando os efeitos de pH (4,5-6,5), temperatura (30-45 ºC), concentração de lactose (50-250 g L-1) e biomassa celular seca (1-2 g L-1). Foram realizadas 29 fermentações em hipoxia além de 7 fermentações para validar a equação obtida na MSR. Temperatura foi o fator mais significante na produção de etanol, seguido de pH, biomassa celular e concentração de lactose. As condições para produção de etanol com rendimentos superiores a 90% foram: temperatura entre 33,3-38,3 ºC, pH entre 4,7-5,7, biomassa celular entre 1,26-1,68 g L-1 e concentração de lactose entre 50-108 g L-1. A equação gerada no processo de otimização foi validada podendo, deste modo, ser utilizada para futuros processos de escalonamento da produção de etanol utilizando K. marxianus UFV-3. Para analisar como as condições de cultivo influenciam a secreção de proteínas de K. marxianus UFV-3, esta levedura foi cultivada em batelada, batelada alimentada (taxa de alimentação inicial Do - 0.05 e 0.1 h-1) e cultura contínua (diluição - D - 0.1 e 0.3 h-1). Os sobrenadantes dos cultivos foram analisados em SDS-PAGE e em todos os cultivos observou-se baixa diversidade de proteínas secretadas. Entretanto nos cultivos em batelada alimentada (Do=0.05 h-1) e cultivo contínuo (D=0.1 h-1) detectou-se uma maior concentração e diversidade de proteínas que nos demais cultivos, além de, em ambos os cultivos, obtivemos uma proteína secretada em maior proporção que as demais. Para identificar as proteínas do secretoma K. marxianus UFV-3 foi cultivada em cultura contínua (D=0.1 h-1) devido à reprodutibilidade deste método, além de, maior controle e homogeneidade dos cultivos. As amostras dos cultivos contínuos foram fracionadas por tamanho em um gel de digestão seguido de separação reversa dos peptídeos em um sistema de nano-LC e posterior identificação dos peptídeos em MALDI-TOF/TOF. De um total de nove proteínas, oito proteínas foram identificadas como sendo estruturais ou de membrana e a proteína que foi diferencialmente secretada no meio foi identificada como endopoligalacturonase endoPG (EC: 3.2.1.15). EndoPG é uma proteína de interesse biotecnológico e foi caracterizada com atividade ótima na temperatura de 59,5 ºC e no pH 5,1. Além disso, verificou-se que esta enzima não é secretada em meio contendo glicose, por outro lado endoPG é secretada em meio contendo lactose, galactose e principalmente em meio contendo glicerol.Item Predição in silico de Proteínas Extracelulares de Kluyveromyces lactis e suas relações com fatores transcricionais(Universidade Federal de Viçosa, 2008-07-31) Brustolini, Otávio José Bernardes; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Cruz, Cosme Damião; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4788274A6; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/0928279245502410; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; Yotoko, Karla Suemy Clemente; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763141P7O banco de dados da Kluyveromyces lactis constituído de 5327 seqüências de proteínas (http://cbi.labri.fr/Genolevures) foi submetido a quatro algoritmos de predição para identificar o potencial secretome extracelular. O primeiro,SignalP v3 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0), que identifica a presença de peptideo sinal na porção N-terminal e o sítio de clivagem da peptidase sinalagrupou 698 proteínas.Deste grupo, o Phobius(http://phobius.sbc.su.se), que prevê a topologia de domínios transmembranas a partir das sequencias primárias, indicou 260 sem domínios transmembranas.Outros dois algoritmos, big-PI predictor(http://mendel.imp.ac.at/gpi/gpi_server.html),capaz reconhecer marcas de de ancoras GPI (Glicosilfosfatidilinositol) e WoLF PSORT(http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)capaz de identificar assinaturas para a localização em compartimentos subcelulares apontaram 236 proteínas sem ancoras GPI e 101 endereçadas ao meio extracelular. Como controle positivo, os mesmos algoritmos foram testados e predisseram corretamente 95 proteínas de leveduras Saccharomycetes encontradas nos bancos de dados públicos (NCBI e UNIProt) e anotadas como extracelulares. Como controle negativo foram preditas como intracelular 95 seqüências aleatórias do banco de dados da K. lactis. O grupo controle positivo e o grupo predito foram comparados pelo teste estatístico T2 de Hotelling. Não foram evidenciadas diferenças significativas entre os valores das médias dos grupos.A condição fisiológicana qual estas proteínas extracelulares são expressas foi analisada relacionando suas seqüências promotoras com os fatores transcricionais ortólogos da Saccharomyces cerevisiae. A metodologia aplicada foi o "Yeastract" (http://www.yeastract.com) que localiza sítios de ligação ao DNA dos fatores transcricionais de S. cerevisiaenas seqüências promotoras dos ORFs das proteínas preditas como extracelulares. A condição fisiológica que favorece a expressão para o meio extracelular foi obtida pela pesquisa dos termos descritos pelo "Gene Ontology"(http://www.geneontology.org). Os fatores transcricionais que mais se relacionam com as seqüências preditas foram aqueles associados com resposta a estresse. Também foi indicado que o estresse ácido e limitação de nitrogênio (aminoácidos) exercem influência na expressão das proteínas extracelulares.Item Produção de estreptavidina recombinante pela levedura Pichia pastoris(Universidade Federal de Viçosa, 2006-02-20) Fonseca, Marisa Cristina da; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4744091Z4; Passos, Frederico José Vieira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781218J9; Guimarães, Valéria Monteze; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4798758T3; Nascimento, Antonio Galvão do; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4797432E8; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7Com o intuito de utilizar estreptavidina como alvo para isolar proteínas de interesse numa coluna biotinilada, P. pastoris KM71 recombinante contendo o gene do core da estreptavidina, foi cultivada em regime de batelada alimentada na fase de produção de biomassa, alcançando uma concentração de 150 g L-1. Essa biomassa foi alcançada com um novo protocolo, que além de reduzir os passos, introduziu um aparato simples, mas eficiente de dispersão de ar. Um reator com capacidade para 1 L, com 200 mL de meio mínimo com glicerol, foi inoculado com uma pré-cultura para uma A600 inicial de 0,2. Após 24 horas de incubação, a 25 ºC, 500 rpm e injeção e dispersão de ar através de pedra porosa, a alimentação foi iniciada com meio de sais basais e glicerol até atingir um volume de 400 mL. A concentração de 2,0 moles L-1 de glicerol e fluxo de 0,11 mL min-1 utilizados na alimentação, permitiram obter máxima biomassa. Na fase de indução de estreptavidina, foi estudada a reutilização da biomassa na produção de estreptavidina em duas condições: livres em suspensão e imobilizadas em partículas de alginato de cálcio. Em ambos os casos a proteína produzida apresentou-se biologicamente funcional, exibindo ligação esperada à biotina. A concentração de estreptavidina no sobrenadante da cultura de células livres no período de máxima indução (96 horas) atingiu 4,0 g L-1, reduzindo para 3,2 e 0,87 g L-1 respectivamente em duas reutilizações. Quando comparada às concentrações de estreptavidina obtidas pelas células livres em cada utilização, a imobilização resultou na produção de 75% na primeira utilização, 50% na segunda, mas alcançando quase 80% na terceira utilização. A imobilização e a reutilização da biomassa de P. pastoris recombinante ainda não haviam sido reportadas e a produção de estreptavidina nessas condições demonstrou ser uma técnica em potencial.Item Proteoma extracelular de Kluyveromyces lactis em cultura contínua sob limitação de nitrogênio(Universidade Federal de Viçosa, 2008-03-13) Santos, Agenor Valadares; Santoro, Marcelo Matos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/index.jsp; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4704067Y1; Santos, Vera Lúcia dos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4709316J2; Santos, Miriam Teresinha dos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4786872Z0A identificação de proteínas extracelulares de leveduras em cultura contínua pode oferecer informações sobre a influência do status nutricional na via de captura de nutrientes alternativos. Essa análise auxilia a otimização das condições necessárias para a produção dessas proteínas com o máximo rendimento, além de oferecer uma estratégia de construção de um sistema de expressão e secreção de proteínas em leveduras. Neste trabalho, mostra-se o perfil das proteínas extracelulares de culturas de Kluyveromyces lactis submetidas a estresse por nitrogênio. A técnica de cultivo em regime contínuo, aliada à análise proteômica, foi utilizada para investigar a resposta da cultura de K. lactis em duas velocidades de crescimento estabelecidas em função da concentração de nitrogênio, ou seja, 0,03 h-1 e 0,09 h-1. A velocidade de crescimento de 0,09 h-1 mostrou o maior rendimento na produção de proteínas extracelulares (1,54 mg.L-1), maior conversão de glicose em proteína (3,3 x 10-4 g.g-1) e um maior rendimento de biomassa (0,13 g.g-1). Através da análise dos perfis protéicos em SDS-PAGE gradiente de amostras dos extratos extracelulares nas duas velocidades de crescimento, pôde-se distinguir, inicialmente, diferenças no proteoma de culturas de K. lactis. A velocidade de 0,09 h-1 apresentou maior número de bandas quando comparada com o perfil obtido para 0,03 h-1. Na identificação proteômica das bandas excisadas do gel por espectrometria de massa em MALDI-TOF-TOF-MS, os espectros obtidos foram analisados utilizando-se o software MASCOT®. As proteínas sugeridas por essa análise estão relacionadas a processos de ciclo celular, replicação, transcrição, mudanças pós-traducionais, metabolismo de carboidrato, ubiquitinação e degradação celular e são comumente encontradas no interior celular. Os extratos extracelulares de K. lactis também foram analisados por cromatografia líquida bi-dimensional (LC-2D), na qual a velocidade específica de crescimento de 0,09 h-1 apresentou maior número de picos cromatográficos, resultado que indica a presença de maior número de proteínas nessa velocidade com relação a 0,03 h-1. Nas várias análises por espectrometria de massa em MALDI-TOF-TOF-MS, das amostras advindas da cromatografia líquida 2D, obteve-se um total de 95 massas moleculares nas duas velocidades específicas de crescimento; dessas massas, aproximadamente 30% pertencem às amostras da velocidade específica de crescimento de 0,03 h-1 e 70%, à velocidade específica de crescimento de 0,09 h-1. A análise por espectrometria de massa também evidenciou a presença de glicosilações (moléculas de N-acetilglicosamina e de 8 a 15 moléculas de hexose por proteína) e de outras possíveis mudanças pós- traducionais em amostras resultantes da LC-2D de ambas as velocidades específicas de crescimento. Na identificação das proteínas extracelulares, as amostras, obtidas na LC-2D das duas velocidades específicas de crescimento, foram tripsinolizadas e analisadas novamente por espectrometria de massa, e as proteínas sugeridas pela análise foram aquelas de K. lactis ligadas ao trânsito de peptídios e ao metabolismo de carboidrato, enzimas de transcrição e outras enzimas, como transferases, cinases, hidrolases, descarboxilases, oxidases e mutarotases, do mesmo modo que na avaliação anterior; e essas proteínas não obtiveram os scores mínimos para a identificação por homologia ser considerada estaticamente significativa.Item Utilização de Kluyveromyces lactis na expressão da GDPase de Leishmania major.(Universidade Federal de Viçosa, 2009-08-21) Santos, Yaro Luciolo dos; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/6294868436822899; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Paula, Sérgio Oliveira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767540P4A levedura Kluyveromyces lactis apresenta potencial aplicabilidade biotecnológica como hospedeira na produção heteróloga de proteínas recombinantes de interesse biotecnológico. Neste contexto o objetivo deste trabalho foi expressar a proteína GDPase de Leishmania major em K. lactis para fins biotecnológicos aplicados às leishmanioses humana e canina. A GDPase de L. major pertence à família das E-NTPDases ou apirases, proteínas envolvidas na infectividade e virulência de parasitos. A técnica da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) foi utilizada para amplificar uma seqüência de 2073 pb referente a região codificante completa da GDPase de L. major, sendo este amplicon inserido no plasmídeo pKLAC1 nos sítios Sal I e Bgl II. A construção pKLAC1-GDPase foi confirmada por PCR, linearizada pela enzima Ahd I e utilizada para transformação da cepa selvagem de K. lactis CBS 2359. Os transformantes foram selecionados em meio YCB contendo 5 mM de acetamida e cultivados sob condições de indução em batelada em meio YPGal. Extrato e sobrenadante destas culturas foram analisados por SDS-PAGE e Western Blot utilizando um anti-soro policlonal anti-GDPase de L. major. As análises revelaram uma única proteína de cerca de 120 kDa nas cepas selvagem e transformantes de K. lactis. Pesquisa no Genbank revelou a presença de dois genes homólogos a GDPase no genoma da levedura: KlGDA1 e KlYND1que podem explicar a reatividade cruzada. Os resultados demonstram que os transformantes obtidos não produzem a GDPase de L. major, provavelmente devido a não reconstituição do promotor PLAC4 que dirigiria a expressão do gene da GDPase. Porém levanta as hipóteses de que a cepa selvagem possa ser testada quanto à indução da produção de anticorpos contra espécies do gênero Leishmania e de sinalizar que o sistema utilizado contém falhas que comprometem seu uso, devido à dependência de reconstituição do promotor PLAC4.