Fisiologia Vegetal

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Aclimatação da maquinaria fotossintética do cafeeiro à alteração da força-dreno e à seca, em função da restrição do volume radicular
(Universidade Federal de Viçosa, 2005-09-02) Ronchi, Cláudio Pagotto; Matta, Fábio Murilo da; http://lattes.cnpq.br/9736715018118319
Neste trabalho, foram feitos dois experimentos, conduzidos separadamente e analisados como tal, para investigar (i) os efeitos da restrição do volume radicular no crescimento e aclimatação fotossintética em Coffea arabica e (ii) os efeitos de taxas de imposição e severidade do déficit hídrico sobre a fotossíntese e metabolismo de carboidratos em C. canephora. No primeiro, plantas de C. arabica cv Catuaí Vermelho IAC 44, cultivadas em vasos de diferentes volumes (3 L - pequeno, 10 L - médio e 24 L - grande), foram avaliadas em duas épocas, aos 115 e 165 dias após o transplantio (DAT), de modo a obterem- se diferentes graus de restrição radicular. Os efeitos da alteração na relação fonte:dreno foram estudados, procurando-se investigar os possíveis mecanismos, estomáticos e não-estomáticos, de aclimatação fotossintética. O aumento da restrição radicular causou forte redução no crescimento da planta, associada ao aumento na razão raiz:parte aérea. Os tratamentos não afetaram o potencial hídrico foliar, tampouco os teores foliares de nutrientes, com exceção da concentração de N, que se reduziu fortemente com o incremento da restrição radicular, apesar da disponibilidade adequada no substrato. As taxas fotossintéticas foram severamente reduzidas pelo cultivo das plantas nos vasos de pequeno volume, devido, principalmente, a limitações não-estomáticas, e.g., redução na atividade da Rubisco. Aos 165 DAT, os teores de hexoses, sacarose e aminoácidos diminuíram, enquanto os de amido e hexoses-P aumentaram, com a redução do tamanho do vaso. As taxas fotossintéticas correlacionaram-se significativa e negativamente com a razão hexose:aminoácidos, mas não com os níveis de hexoses per se. As atividades de invertase ácida, sintase da sacarose (SuSy), sintase da sacarose-fosfato (SPS), bisfosfatase da frutose-1,6-bisfosfato (FBPase), pirofosforilase da ADP-glicose (AGPase), fosforilase do amido (SPase), desidrogenase do gliceraldeído-3-P (G3PDH), fosfofrutocinase dependente de PPi (PPi-PFK) e desidrogenase do NADP:gliceraldeído-3-P (NADP-GAPDH), e as razões 3-PGA:Pi e glicose-6-P:frutose-6-P decresceram, particularmente nas plantas sob restrição radicular severa. A aclimatação da maquinaria fotossintética não esteve relacionada a limitações diretas pela redução da síntese de produtos finais da fotossíntese, mas sim a reduções na atividade da Rubisco. Aparentemente, a aclimatação fotossintética foi reflexo do status deficiente de nitrogênio, em função do aumento da restrição radicular. No segundo experimento, plantas de C. canephora (clone 109A) também foram cultivadas em vasos de volumes contrastantes (6 L - pequeno e 24 L - grande), durante 11 meses. Em seguida, foram submetidas ao déficit hídrico, via suspensão da irrigação, aplicando-se, neste caso, duas taxas de imposição (rápida, nos vasos pequenos, e lenta, nos vasos grandes), e dois níveis de déficit hídrico: potencial hídrico na antemanhã (Ψ am ) equivalente a -2,0 MPa (déficit moderado) e - 4,0 MPa (déficit severo). Foram estudadas as respostas da maquinaria fotossintética e do metabolismo de carboidratos à seca, em função tanto da taxa de imposição como da severidade do déficit hídrico. Após suspender-se a irrigação, os níveis de déficit moderado e severo foram atingidos aos quatro e seis dias nas plantas dos vasos de 6 L, e aos 12 e 17 dias naquelas dos vasos de 24 L, respectivamente. Os tratamentos aplicados não afetaram as concentrações de clorofilas e carotenóides. Pequenas alterações nos parâmetros de fluorescência foram observadas, mas apenas nas plantas sob déficit severo, imposto lentamente. Sob déficit severo, os níveis de prolina aumentaram 31 e 212% nas plantas dos vasos pequenos e grandes, respectivamente, em relação aos das plantas-controle. A seca (Ψ am = -4,0 MPa) aumentou o extravazamento de eletrólitos em 183%, independentemente do tamanho do vaso. A taxa fotossintética reduziu-se em 44 e 96%, a Ψ w de -2,0 e -4,0 MPa, respectivamente, em relação às plantas-controle, sem, contudo, observarem-se alterações expressivas nesses parâmetros, em função das diferentes taxas de imposição do déficit hídrico. O déficit hídrico reduziu a condutância estomática e a transpiração, mas apenas quando foi severo. De modo geral, o metabolismo de carboidratos, em resposta à seca, foi afetado pela taxa de imposição do déficit hídrico. Não obstante, as atividades de enzimas- chave do metabolismo do carbono (AGPase, invertase ácida, SuSy, SPS, FBPase, G3PDH, SPase, PPi-PFK) foram pouco ou nada afetadas pelas taxas de imposição e severidade do déficit.
Acúmulo de isoflavonas durante o enchimento do grão de soja e mapeamento de locos que controlam essa característica
(Universidade Federal de Viçosa, 2004-03-12) Colombo, Lucinete Regina; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://lattes.cnpq.br/2983600944854240
Este trabalho foi realizado com a linhagem BARC-8 e a variedade comercial IAC-100, com os objetivos de: analisar a expressão do(s) gene(s) que codifica(m) a(s) enzima(s) sintase de isoflavona (IFS) em soja, e avaliar o acúmulo de isoflavonas ao longo do enchimento do grão em plantas cultivadas em duas diferentes temperaturas; mapear e identificar marcadores do tipo microssatélites e RAPD ligados a QTLs associados à determinação do conteúdo de isoflavonas em sementes de soja. Em um primeiro experimento, as plantas da linhagem BARC-8 e da variedade comercial IAC-100 foram cultivadas em dois regimes de temperaturas: 33/22 e 28/13 °C – dia/noite. Foram detectadas seis formas de isoflavonas ao longo do enchimento do grão de soja (daidzina, genistina, glicitina, malonildaidzina, malonilgenistina e malonilglicitina) tanto para IAC-100 como para BARC-8. Os resultados das análises de variância indicaram ter havido variação significativa para teor de isoflavonas em função do genótipo, da temperatura e dos estádios de desenvolvimento, bem como interação entre os três fatores analisados. A análise da cinética de acúmulo do RNA de IFS, pela técnica de RT-PCR, evidenciou que não há uma relação entre o acúmulo de isoflavonas e a quantidade de transcritos para IFS durante o enchimento do grão. Estudos posteriores deverão ser conduzidos, visando fazer uma análise quantitativa, para poder inferir como se comporta a expressão da IFS ao longo do enchimento do grão e se ocorre influência da temperatura sobre o acúmulo do seu transcrito. No segundo experimento, foi utilizada uma população de 93 plantas F 2 , obtidas do cruzamento entre BARC-8 e IAC-100, que são contrastantes para os teores de daidzina, genistina, malonildaidzina, malonilgenistina, isoflavonas totais e proteína. Os teores das isoflavonas foram determinados por cromatografia líquida de alta eficiência e o teor protéico pelo método de Kjeldahl. A população foi analisada, utilizando-se marcadores microssatélites e RAPD. Foram obtidos 22 grupos de ligação pouco saturados, contendo 82 marcadores, além de 25 marcas não ligada. Na análise de marca simples foram identificados 13 marcadores que explicaram a variação dos teores de daidzina. Destes, o marcador Satt318 explicou 17,39%. Na regressão múltipla, as marcas Satt318, Satt232 e Satt518 explicaram, juntas, cerca de 31,5% desta característica. Seis marcadores explicaram a variação dos teores de genistina. Destes, o Satt318 explicou 16,05% da variação. Na análise de regressão múltipla, as marcas Satt318, Satt350, Satt127 e OPK20 explicaram, juntas, cerca de 34% da variação. Onze marcadores foram identificados para malonildaidzina. Destes, o Satt318 explicou 16,13%. Na análise de regressão múltipla, as marcas Satt318, Satt232, Satt417 e Satt197 explicaram, juntas, cerca de 33% da variação. Dezesseis marcadores foram encontrados para malonilgenistina. Destes, o Satt318 explicou 12,05% da variação. Na análise de regressão múltipla, as marcas Satt318, Satt468, Satt495, Satt350, Satt127 e Satt499 explicaram, juntas, cerca de 45% da variação. Dez marcadores foram identificados para isoflavona total. Destes, o Satt318 explicou 13,59% da variação. Na análise de regressão múltipla, as marcas Satt318, Satt468 e OPAW04 explicaram, juntas, cerca de 26% da variação. Sete marcadores foram identificados para proteína total. Destes, o OPK20 explicou 10,06%. Na análise de regressão múltipla, as marcas OPK20, Satt512, OPU02 e Satt398 explicaram, juntas, cerca de 26% da variação. No mapeamento por intervalo composto, foi identificado um único QTL associado ao teor da isoflavona daidzina no grupo de ligação K, que explicou 28% desta característica. As marcas que mais explicaram as diferentes características avaliadas não foram alocadas no mapa de ligação e, estudos posteriores deverão ser conduzidos, visando aumentar o grau de saturação do mapa. Isto poderá permitir a identificação de QTLs para as diferentes características analisadas.
Alterações fisiológicas causadas pelo arsênio, genotoxidade e importância do mecanismo mismatch repair no reparo do DNA em Arabidopsis thaliana
(Universidade Federal de Viçosa, 2013-04-02) Barbosa, Alice Pita; Loureiro, Marcelo Ehlers; http://lattes.cnpq.br/3328314264518039
O arsênio (As) é um elemento não só tóxico, mas também altamente genotóxico aos seres vivos. Muitas lacunas precisam ser preenchidas com relação aos processos causadores de toxidade do As em plantas, bem como os mecanismos de tolerância e sensibilidade a este metalóide. Para isso, plantas de Arabidopsis thaliana (WT, mutantes msh2 e transgênicas repórteres em mutações) e Allium cepa foram expostas a 0, 2, 8 e 16 mg As L -1, durante cinco dias, em sistema hidropônico ou em meio de cultura. As plantas acumularam grandes teores de As nas raízes e apresentaram elevado fator de translocação para a parte aérea, e também alterações no acúmulo de nutrientes. Os sintomas visuais se intensificaram com o aumento da concentração de As na solução nutritiva. As raízes adquiriram coloração escura e aspecto gelatinoso, danificado e aumento no comprimento e densidade dos pêlos; a parte aérea apresentou aumento dos teores de antocianinas e sinais de senescência precoce, bem como alterações na espessura de tecidos. O estresse oxidativo e a redução dos teores de fósforo foram apontados como os principais efeitos do As capazes de causar toxidez, evidenciando os danos indiretos deste elemento no organismo. Foram verificadas importantes alterações fotossintéticas, bem como indícios de danos ao processo de respiração celular devido o aumento da expressão de genes codificantes de oxidases alternativas. Também foram observadas alterações nos teores de açúcares em folhas jovens, maduras e raízes. O As promoveu fragmentação do DNA nos ápices radiculares de A. cepa e aumento das taxas de mutação pontual e de recombinação-não homóloga em A. thaliana. O significativo aumento da expressão dos genes msh2 e msh7, codificadores de enzimas-chave do processo mismatch repair, que realiza o reparo de bases danificadas ou erroneamente inseridas no DNA, sugeriu a importância deste mecanismo no combate à genotoxidade do As em A. thaliana. Isso foi confirmado pela maior sensibilidade observada nas plantas mutantes msh2 ao As, detectada visualmente via aumento da peroxidação de lipídios. Observou-se inibição da atividade da protease caspase-3, associada ao processo de morte celular programada, reforçando a capacidade de inibição da atividade enzimática pelo As.
Alterações na assimilação e metabolismo do carbono em plantas de soja sob condições de atmosfera enriquecida com CO 2
(Universidade Federal de Viçosa, 2003-07-08) Lobo, Francisco de Almeida; Cano, Marco Antonio Oliva; http://lattes.cnpq.br/0296723198831816
Duas linhagens de soja [Glycine max (L.) Merr.], originadas do Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja do Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO), da Universidade Federal de Viçosa (UFV), foram previamente selecionadas como contrastantes em teores de proteínas nas sementes, taxas fotossintéticas líquidas e produções, com o objetivo de serem avaliadas as alterações na assimilação e no metabolismo do carbono, quando submetidas ao dobro da concentração de CO 2 atmosférico atual (≈720 μmol mol -1 ). As hipóteses testadas foram: (a) plantas sob elevada concentração de CO 2 atmosférico aumentam a taxa fotossintética e a eficiência instantânea no uso da água, (b) o excedente de fotoassimilados, nas plantas crescidas sob 720 μmol mol -1 de CO 2 , contribui para o incremento da biomassa total e da produção de sementes, retarda a senescência foliar e promove maior atividade dos nódulos, incrementando os teores protéicos das sementes e (c) o processo de aclimatação fotossintética depende do tempo de exposição das plantas às elevadas concentrações de CO 2 atmosférico. As plantas foram cultivadas em câmaras de topo aberto, dentro de casa-de-vegetação, sendo que, no interior destas câmaras, as concentrações de CO 2 atmosférico foram permanente monitoradas para que a metade delas permanecesse nas condições atmosféricas atuais e a outra metade, com o dobro da concentração de CO 2 atual. Para atender aos objetivos do trabalho, foram realizadas determinações de intercâmbio gasoso, componentes do rendimento e produção final, teor de carbono e proteína bruta das sementes, teor de carboidratos não estruturais nas folhas, atividade de enzimas do metabolismo do carbono nas folhas e teor de ureídeos na seiva do xilema, em dois experimentos de enriquecimento atmosférico com CO 2 , um a partir da floração, e outro durante todo o ciclo de vida das plantas. Verificou-se que, independentemente da linhagem, as plantas cultivadas sob elevada concentração de CO 2 atmosférico tiveram um incremento na taxa fotossintética da ordem de 75%, na fase de formação das sementes, e de 300%, na fase de início de maturação, quando submetidas aos tratamentos diferenciados de concentração de CO 2 a partir da floração. A eficiência instantânea no uso de água destas plantas aumentou em 142,2%, na fase de formação de sementes, e em 189,2% no início de maturação. Para aquelas plantas mantidas permanentemente sob elevada concentração de CO 2 atmosférico, verificou-se um incremento de 46% na taxa fotossintética, independentemente da linhagem e da etapa de desenvolvimento. Neste caso, a eficiência instantânea no uso de água aumentou em 230,4%, na etapa de completa formação das vagens, e 218,5%, na etapa de formação de sementes. Em ambos experimentos, a maior eficiência instantânea no uso de água foi determinada pelo incremento nas taxas fotossintéticas. Constatou-se que a aclimatação fotossintética foi reversível, que ocorreu somente quando as plantas foram mantidas permanentemente sob elevada concentração de CO 2 e que diferiu entre as linhagens. As plantas cultivadas sob elevada concentração de CO 2 atmosférico apresentaram um incremento na biomassa total e na de sementes da ordem 25,6% e de 30,9%, respectivamente, não apresentando qualquer alteração significativa no índice de colheita, quando os tratamentos diferenciados de CO 2 foram aplicados a partir da floração. Nas plantas que permaneceram todo o ciclo de vida sob o efeito de altas concentrações de CO 2 , esses incrementos foram respectivamente da ordem de 58,0% e 22,1%, porém com redução no índice de colheita que passou de 0,37 para 0,29. O teor de proteína bruta das sementes foi semelhante para as populações de planta, independentemente das linhagens ou dos tratamentos com CO 2 , quando estes foram aplicados a partir da floração, e em média igual a 41,9%. Contudo, as plantas expostas continuamente à elevada concentração de CO 2 atmosférico tiveram reduzido o teor protéico de suas sementes que foi igual a 30,4% em comparação com o controle sob concentração de CO 2 atmosférico atual, que foi igual a 33,7%. Não foi verificado qualquer retardamento na senescência foliar de ambas linhagens sob elevada concentração de CO 2 atmosférico, e tampouco essa condição propiciou qualquer alteração na atividade dos nódulos na etapa de formação de sementes.
Amadurecimento pós-colheita de banana ‘Prata-Anã’ tratada com 1- metilciclopropeno
(Universidade Federal de Viçosa, 2003-12-05) Mendonça, Fábio Vinícius de Souza; Puschmann, Rolf; http://lattes.cnpq.br/9018905989963426
O amadurecimento da banana é um processo irreversível, estimulado pela produção autocatalítica do etileno e retardado pelo 1-metilciclopropeno (1-MCP), potente inibidor da ação desse regulador. Este trabalho objetivou examinar a vida útil e a qualidade de bananas (Musa spp. grupo AAB, subgrupo Prata, cv. Prata-Anã) após o tratamento com 1-MCP. Buquês de três frutos da segunda penca foram tratados com 0 e 60 nL L -1 de 1- MCP, por 8 horas, a 20 oC, seguindo armazenamento a 20 + 1 oC e 12 + 1 oC. O tratamento foi realizado em, no máximo, 24 horas após a colheita. No armazenamento a 20 oC, o amarelecimento da casca, o acúmulo de sólidos solúveis totais, a degradação de clorofilas, o início da produção de etileno e a conversão de amido para açúcares solúveis totais foram retardados em cerca de 15 dias, mais que duplicando o período de conservação, em relação aos frutos não-tratados. Após o aumento da produção de etileno os frutos não-tratados e armazenados a 12 oC desenvolveram gradativamente a coloração da casca, simultaneamente à degradação de clorofilas e à conversão de amido para açúcares solúveis totais, aumentando assim a concentração de sólidos solúveis totais. Nos frutos tratados com 1- MCP e armazenados a 12 ° C foi verificado que o mesmo comportamento ocorreu, porém mais lentamente. O completo amadurecimento desses frutos ocorreu em torno de 45 dias, após transferência para 20 oC, o que aconteceu em torno dos 30 dias. Os frutos tratados, mantidos a 20 oC, e os não-tratados, a 12 o C, apresentaram resultados semelhantes; em ambos os tratamentos ocorreu retardamento do amadurecimento em cerca de 15 dias em relação aos frutos não-tratados, mantidos a 20 oC. Com base nas análises realizadas, verificou-se que o 1-MCP retardou o amadurecimento dos frutos, sem alterar a qualidade final dos mesmos, em relação aos frutos não-tratados.
Análise da atividade do promotor de BiP (Binding Protein) de soja em plantas transgênicas de tabaco
(Universidade Federal de Viçosa, 2005-02-23) Rodrigues, Leonardo Augusto Zebral; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/3353898697685637
A proteína BiP ("binding protein") de plantas tem sido descrita como um importante mediador de translocação, dobramento e montagem de proteínas recém-sintetizadas no lúmem do retículo endoplasmático, exibindo uma forte indução em resposta a uma variedade de estresses bióticos e abióticos. Apesar de sua relevância funcional, muito pouco se sabe com relação aos mecanismos de regulação da expressão dos genes BiP de plantas e da estrutura de seus promotores. Nesta investigação, dois promotores de BiP de soja, designados gsBiP6 e gsBiP9, bem como diferentes extensões de suas extremidades 5' foram fusionados ao gene repórter beta-glucuronidase (GUS) e introduzidas em Nicotiana tabacum via transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Os promotores de gsBiP6 e gsBiP9 possuem cis-elementos gerais, característicos de promotores de genes de plantas, como as seqüências de transcrição CAAT e TATA, e cis-elementos que respondem a estresses do retículo endoplasmático (ERSE), além de seqüências relacionadas com o G-box. Ensaios de atividade de GUS em discos foliares transformados com os genes quiméricos BiP6-GUS e BiP9-GUS demonstraram que o promotor de gsBiP6 é induzido por uma variedade de estresses, enquanto gsBiP9 é induzido apenas por tunicamicina, um potente ativador da via de resposta a proteínas mal-dobradas (UPR). Além disso, análises histoquímicas de plantas transformadas com as construções -358pbip6-gus (BiP6) e -2200pbip9-gus (BiP9) revelaram que os promotores de BiP produziram um padrão intenso e uniforme de expressão de GUS em folhas, caules, raízes e meristemas apicais. Este padrão de distribuição espacial da atividade de GUS está correlacionado com uma expressão desses genes em tecidos que apresentam alta atividade celular secretória e alta proporção de células em um processo ativo de divisão celular. Análises de deleções do promotor de gsBiP9 em plantas transformadas identificaram dois domínios regulatórios cis-atuantes, denominados CRD-1 (-1090 a -670) e CRD-2 (-670 a +1), que são importantes para regulação espacial dos promotores de BiP em condições normais de desenvolvimento. A região de CRD-1 é caracterizada pela predominância quase absoluta de adenina e timina exibindo uma alta atividade do gene repórter GUS. Este domínio funcional possui uma atividade similar à de “enhancer”, já que é capaz de restaurar altos níveis de expressão quando fusionado diretamente à extremidade 5’ do promotor de BiP9. De fato, a atividade do gene repórter -glucuronidase (GUS) nas plantas contendo esse domínio regulatório cis-atuante foi praticamente idêntica àquela exibida pelo promotor inteiro. Além disso, a análise histoquímica e fluorimétrica de plantas contendo tais seqüências mostraram um aumento significativo na atividade do gene repórter GUS. A região de CDR-2 é caracterizada por conter elementos regulatórios positivos, que coordenam a expressão tecido-específica do promotor de gsBiP9, sendo capaz de restaurar em parte, os níveis de expressão basal do gene repórter GUS, uma vez que se detectou atividade do promotor em raízes e caule, entretanto, os níveis de expressão em folhas, principalmente na região dos feixes vasculares, não foram suficientemente altos e nem tão pouco de forma generalizada como visto nas construções contendo o promotor completo de BiP, sendo necessário seqüências adicionais delimitadas até a posição -1090 para uma alta atividade. Estes resultados sugerem que o controle da expressão dos genes BiP de plantas envolve múltiplos e complexos mecanismos e depende de uma complexa integração de múltiplos cis-elementos regulatórios no promotor.
Análise da diversidade genética de germoplasma de Theobroma cacao L. da Amazônia Brasileira por microssatélites
(Universidade Federal de Viçosa, 2003-05-30) Mota, Jay Wallace da Silva e; Moreira, Maurílio Alves; http://lattes.cnpq.br/3597632702970170
Uma amostra de 172 clones de cacau (Theobroma cacao L.), provenientes de amostras coletadas em populações espontâneas de 16 bacias hidrográficas da Amazônia Brasileira, foi caracterizada por meio de microssatélites visando identificar genótipos, estimar a diversidade genética e estruturas genéticas das populações de origem. Foram detectados 187 alelos a partir de 30 locos microssatélites, dos quais 29 apresentaram polimorofismo, seletivamente neutros e independentes, permitindo identificar 169 (98,3%) genótipos distintos e apenas três genótipos repetidos (CAB 731, CAB 732 e CAB 734), oriundos da bacia do Rio Uatumã-AM. Os genótipos agrupararam-se segundo suas origens geográficas, com a dissimilaridade variando de 0,0 a 0,79 e média de 0,59. Foram identificados 68 alelos raros, dos quais 23 exclusivos, destacando-se as bacias do Acre e do Alto Amazonas com maior número de alelos privados, corroborando suas maiores riquezas alélicas. Todas as subpopulações apresentaram boa diversidade genética, exceto as de Rondônia que mostraram menor variabilidade para todos os indicadores utilizados. A diversidade genética total foi 0,658 contra uma heterozigosidade observada de 0,295, observando-se défict de heterozigosidade em todas as amostras, caracterizado por um coeficiente de endogamia de 0,408 e taxa de fecundação cruzada de 42 %. As subpopulações apresentaram forte estruturação, com significativa diferenciação (G ST = 0,292 e F ST = 0,290) e alto coeficiente de parentesco (R EL = 0,367) dos indivíduos dentro das subpopulações. A análise das amostras agrupadas (Acre, Alto Amazonas, Rondônia e Baixo Amazonas) mostra 66,6% da variabilidade genética dentro das subpopulações, 14,9 % entre subpopulações dentro dos grupos e 18,5% entre os quatro grupos. As populações do Alto Amazonas se destacaram em termos de contribuição relativa à diversidade e riqueza alélica total. No acre, a despeito da alta diversidade e riqueza alélica, apenas a bacia do Rio Tarauacá apresenta contribuição relativa positiva. As demais demonstram redundância na composição alélica, com contribuições relativas negativas. O dendrograma de distância genética D de Nei apresentou topologia mais robusta que δμ 2 e D L (-ln(1-F ST ), confirmando o agrupamento das subpopulações do Acre e Alto Amazonas e destacando a elevada divergência da bacia do Rio Jamari em relação às demais. Os resultados realçam a importância de novas coletas na bacias hidrográficas do Amazonas e Acre (especialmente a do rio Tarauacá) e a necessiade de agregar o máximo de novas bacias visando reunir o máximo de novos alelos, alelos raros e/ou exclusivos, de modo a enriquecer as coleções de germoplasma e a minimizar perdas por erosão genética.
Atividade de enzimas envolvidas no estresse oxidativo em frações subcelulares de plantas submetidas à baixa temperatura
(Universidade Federal de Viçosa, 2002-03-27) Antunes, Flávia; Silva, Marco Aurélio Pedron e; http://lattes.cnpq.br/7115721903093899
Neste trabalho, investigaram-se os efeitos da baixa temperatura sobre a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POX) e catalase (CAT), em mitocôndrias captadoras de Ca 2+ (isoladas de hipocótilos de soja e coleóptilos de milho) em comparação com mitocôndrias incapazes de captar Ca 2+ (isoladas de tubérculos de batata e raízes de beterraba). Adicionalmente, compararam-se as atividades dessas enzimas mitocondriais com suas isoenzimas presentes em outras frações celulares. Os tubérculos de batata e as raízes de beterraba foram mantidos à temperatura ambiente (controle) e a 5°C por dez dias. Para as plântulas de soja e milho, o tratamento controle correspondeu à sua manutenção à temperatura de 28°C, durante quatro dias após o plantio. O tratamento com frio consistiu em manter outro grupo de plântulas por mais dois dias, transferindo-as para temperatura de 5°C. A atividade da SOD, nas diversas espécies, foi maior na fração solúvel do que nas organelas isoladas. Na fração solúvel, a atividade da SOD foi reduzida pela baixa temperatura, apenas em beterraba, milho e soja, não apresentando diferença significativa em batata. Não foi detectada atividade de SOD nos peroxissomas na maioria das espécies estudadas, à exceção da beterraba. O frio não alterou a atividade da POX nas mitocôndrias e nos proplastídeos de todas as espécies estudadas, porém houve redução na atividade dessa enzima em peroxissomas de batata e beterraba. O frio reduziu a atividade da CAT em mitocôndrias de batata e aumentou em soja, sem alterações significativas nas outras espécies. Nos tratamentos com baixa temperatura, não houve alterações significativas na atividade da CAT em proplastídeos. Em peroxissomas, houve redução em beterraba e milho. Esses resultados não permitem estabelecer um padrão de comportamento das enzimas estudadas em resposta ao frio, nem estabelecer uma relação direta entre a capacidade mitocondrial de captação de cálcio e a atividade das enzimas avaliadas.
Avaliação do efeito da condição acídica e da tiouréia na quebra da dormência de sementes de Stylosanthes humilis H.B.K
(Universidade Federal de Viçosa, 2005-02-17) Cabrini, Elaine Cristina; Barros, Raimundo Santos; http://lattes.cnpq.br/0079433403548655
A quebra da dormência fisiológica de sementes escarificadas de estilosante (Stylosanthes humilis H.B.K.), leguminosa forrageira tropical, de ciclo anual, foi promovida por soluções de pH muito baixo (2,0 e 2,5) e de tiouréia. O tempo mínino de exposição das sementes dormentes escarificadas à água, pH 2,0, requerido para promoção de germinação acima de 80%, foi 6 h; em solução de tiouréia, à concentração 100 mol m -3 , mostrou-se inferior a 12 h. O início do processo germinativo antecedeu o início da produção de etileno na maioria dos tratamentos empregados. A germinação estimulada pela condição acídica não foi inibida pelos inibidores da biossíntese e da ação de etileno, apenas observando-se uma leve redução por ação de aminoetoxivinilglicina (AVG), em solução-tampão McIlvaine, pH 2,5. Em atmosfera livre de etileno, observou-se apreciável número de sementes germinadas, ainda que tratadas com AVG mais Co 2+ ; os níveis de etileno mostraram-se baixos após a liberação do regulador previamente fixado na solução de perclorato de mercúrio. Aparentemente, os baixos pH(s) per se promoveram a quebra de dormência das sementes. Os inibidores da biossíntese e da ação de etileno também não exerceram qualquer efeito, quando aplicados em conjunto com soluções de tiouréia, exceto por um leve efeito do ácido abscísico. Embora sementes dormentes tratadas com tiouréia produzissem etileno em nível elevado, mesmo que associada aos inibidores da biossíntese e da ação de etileno, e sob atmosfera livre de etileno, aparentemente, o etileno não se mostrou necessário nos momentos iniciais do processo germinativo, desde que uma germinação alta já havia ocorrido antes da emanação do fitorregulador gasoso.
Avaliação fisiológica de plantas de Urucum (Bixa orellana L)
(Universidade Federal de Viçosa, 2004-09-29) Rodríguez Ortíz, Carmen Eugenia; Otoni, Wagner Campos; http://lattes.cnpq.br/2783222284467182
O presente trabalho teve por objetivos: (a) analisar a capacidade fotossintética de dois grupos de material vegetal sob condições de campo: plantas adultas com frutos verdes pilosos e plantas com frutos avermelhados pilosos; (b) avaliar o desenvolvimento de explantes cultivados in vitro submetidos a diferentes densidades de fluxo de luz; e (c) estudo anatômico de folhas de plantas adultas e in vitro. As hipóteses testadas foram: (a) existem diferenças na capacidade fotossintética entre os dois grupos de planta analisados; (b) alguns dos parâmetros das curvas de resposta da fotossíntese líquida à luz e ao CO² devem estar correlacionados com os teores dos pigmentos cloroplastídicos; (c) os carotenóides totais presentes nas folhas de Urucum podem desempenhar papel foto-protetor ao estresse foto-oxidativo, possibilitando que explantes cultivados in vitro possam se desenvolver a altas densidades de fluxo de luz. Verificou-se que ambos os grupos de plantas não apresentaram diferenças estatísticas significativas em seus parâmetros das curvas de resposta da fotossíntese líquida à luz e ao CO² . Assim sendo, para estes grupos foram encontrados os valores médios seguintes: 19,17 μmol m-² s-¹ para a estimativa assintótica da taxa fotossintética bruta máxima, 22,6 μmol m-² s-¹ para o ponto de compensação de luz, 1274 μmol m-² s-¹ para o ponto de saturação de luz, 15,38 μmol m -2 s -1 para a estimativa assintótica da taxa fotossintética líquida máxima, 63,0 μmol mol-¹ para o ponto de compensação de CO² e 0,1403 mol m-² s-¹ para a eficiência carboxilativa da Rubisco. Foram observadas as seguintes correlações lineares: entre a eficiência quântica máxima e a irradiância de saturação (r = -0,7794; P = 0,0176), entre a estimativa assintótica da taxa fotossintética bruta máxima e a irradiância de saturação (r = 0,8780; P = 0,0018), entre a estimativa assintótica da taxa fotossintética líquida máxima e o ponto de compensação de CO² (r = -0,6242; P = 0,0408), entre a eficiência carboxilativa e o ponto de compensação de CO² (r = -0,8208; P = 0,0067), entre a limitação estomática à fotossíntese e a concentração intercelular de CO² para uma concentração ambiental de 400 μmol mol-¹ (r = -0,8927; P = 0,0012), entre a eficiência quântica e o teor de clorofila a (r = -0,8887; P = 0,0014), clorofila b (r = -0,8505; P = 0,0037) e clorofilas totais (r = -0,9033; P = 0,0008) e entre a limitação estomática à fotossíntese e o ponto de compensação de luz (r = -0,6751; P = 0,0460). Verificou-se que ambos grupos não diferiram entre si nos teores de pigmentos cloroplastídicos, com uma média de 1629,6 mg kg-¹ de clorofila a, 643,4 mg kg-¹ de clorofila b e 2272,9 mg kg-¹ de carotenóides totais; também não houve diferença estatística entre os teores de bixina nas sementes das plantas de ambos os grupos, com um valor médio de 4,42% que as classificam como boas produtoras do corante. Os teores de bixina não se correlacionaram com nenhuma das variáveis da capacidade fotossintética das plantas. Verificou-se a presença de um grande número de idioblastos ramificados nas folhas das plantas adultas e in vitro com presença de substâncias lipofílicas identificadas como sendo bixina, por meio de reação com Sudan IV e cromatografia em camada fina. Os explantes de Urucum cultivados in vitro apresentaram foto-inibição a partir de uma densidade de fluxo de 150 μmol m-² s-¹ , identificado pela relação F v /F m igual a 0,581 aos 45 dias de exposição. Sob condições de foto-inibição, apenas a atividade da peroxidase apresentou incremento estatisticamente significativo, ao passo que a superóxido dismutase e a catalase não alteraram significativamente suas atividades, concluindo-se que os carotenóides não foram ativos na mitigação desse estresse.
Avaliações bioquímicas, fisiológicas e anatômicas dos efeitos de poluentes atmosféricos sobre espécies vegetais de restinga
(Universidade Federal de Viçosa, 2003-09-12) Silva, Luzimar Campos da; Cano, Marco Antonio Oliva; http://lattes.cnpq.br/0437214969395798
Com o objetivo de avaliar os efeitos tóxicos do ferro particulado e do dióxido de enxofre liberados por uma usina de pelotização, localizada no município de Anchieta, ES, sobre parâmetros fisiológicos, bioquímicos e anatômicos, foram determinados os efeitos dos poluentes atmosféricos mediante metodologia de bioindicação ativa e passiva. As espécies avaliadas no biomonitoramento ativo, Eugenia uniflora L. (Myrtaceae) e Clusia hilariana Schlecht. (Clusiaceae), foram colocadas em estações padronizadas e distribuídas em diferentes distâncias: 200 m, 500 m, 800 m, 1400 m e 1700 m em relação à fonte emissora, durante 7 meses. Em experimento simultâneo, as mudas inseridas num solo removido de uma usina de pelotização foram submetidas à chuva ácida simulada constituída de H 2 SO 4 , com pH 3,0 e à chuva controle com pH 6,5, durante 40 dias. Na bioindicação passiva, indivíduos das espécies: Byrsonima sericea DC. (Malpighiaceae), Cordia verbenacea DC. (Boraginaceae) e Psidium guineense SW. (Myrtaceae) foram avaliados numa mata remanescente de restinga, localizada a 200 m da usina (local exposto) e no Parque Estadual Paulo César Vinha (local não-exposto), durante um ano. E. uniflora recebeu deposição de maior quantidade de ferro particulado por área foliar do que C. hilariana, não variando quanto às distâncias da fonte emissora nas duas espécies. Os maiores teores foliares de ferro total foram verificados a 200 m da fonte emissora, nas duas espécies vegetais, enquanto que o maior teor de enxofre total foliar foi observado em E. uniflora, a 800 m e em C. hilariana, a 200 m da fonte emissora. Não se observou variação em altura nas duas espécies vegetais avaliadas e o número de folhas foi menor apenas a 800 m e 1700 m de distância em C. hilariana. O número e a percentagem de folhas cloróticas e necróticas, assim como o índice de fitotoxicidade de cloroses nas duas espécies aumentaram com o prolongamento do tempo de exposição às emissões da usina. Em E. uniflora, a percentagem de folhas cloróticas e necróticas não se modificou com a distância da fonte emissora, enquanto que em C. hilariana, as maiores médias foram observadas a partir de 500 m. Nas duas espécies, o teor de clorofila diminuiu com o tempo de exposição e apenas em plantas de E. uniflora localizadas a 800 m da fonte emissora foram observados maiores teores de clorofila. As plantas de C. hilariana localizadas a 200 m e 500 m da fonte emissora apresentaram maior permeabilidade de suas membranas celulares, que se relacionou com o teor foliar de enxofre. As plantas de C. hilariana apresentaram condutância estomática (g s ), a transpiração (E) e a assimilação líquida de CO 2 (A) mais elevadas nas estações mais próximas à usina emissora, embora isto não tenha contribuído para o aumento da massa seca total. A relação trocas gasosas e teor foliar de enxofre sugeriu que C. hilariana acumulou grande quantidade de enxofre enquanto que E. uniflora praticamente não absorveu o enxofre emitido pela usina de pelotização. Ambas as espécies são bioindicadoras de reação, podendo ser usadas como bioindicadoras ativas de poluição por deposição particulada e dióxido de enxofre. Em relação ao experimento com chuva ácida, nenhuma das espécies apresentou variação na altura das mudas tratadas em relação ao controle, enquanto o índice de fitotoxicidade de necroses foi maior nas plantas de E. uniflora expostas à chuva ácida. Os teores de clorofila a, de clorofila b e de carotenóides foram reduzidos em E. uniflora após o tratamento, enquanto que a relação F v /F m foi maior nas plantas tratadas. Em C. hilariana, nenhum destes parâmetros foi alterado com a chuva ácida. A g s , E e A não variaram nas plantas tratadas em relação ao controle, nas duas espécies avaliadas, após as 40 chuvas simuladas. Nenhuma das espécies mostrou alteração na permeabilidade de suas membranas. Em E. uniflora, apenas a atividade da peroxidase aumentou com o tratamento, enquanto que em C. hilariana, as atividades da dismutase do superóxido, da peroxidase e da catalase aumentaram após as 40 simulações. Nas três espécies avaliadas no biomonitoramento passivo, o teor de ferro foliar foi maior no local exposto às emissões da usina e o teor foliar de enxofre variou nas diferentes espécies analisadas. Os efeitos mais marcantes das deposições da usina sobre as espécies avaliadas no biomonitoramento passivo foram: Em B. sericea, maior teor de clorofila, menor temperatura foliar, maior número de folhas; em C. verbenacea, maior teor de clorofila, maior temperatura foliar, menor número de folhas, flores e frutos; em P. guineense, menor teor de clorofila, maior diferencial de temperatura entre a folha e o ar, maior lançamento de folhas, menor número de folhas. Não foram verificadas flores e frutos neste local. C. verbenacea acumulou maior quantidade de ferro que as demais espécies ocorrendo maior deposição nas reentrâncias nas bases dos tricomas glandulares. As plantas de B. sericea apresentaram menor conteúdo de ferro provavelmente, devido a presença de hipoderme e tricomas malpiguianos, enquanto que em P. guineense, a proteção parece ter sido viabilizada pela hipoderme.
Caracterização bioquímica da proteína S-64, envolvida no transporte de sacarose em soja (Glycine max (L.) Merrill)
(Universidade Federal de Viçosa, 1999-03-04) Pirovani, Carlos Priminho; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/9615448923708075
O cDNA da proteína S-64, homóloga à proteína de ligação à sacarose (SBP), foi previamente isolado de uma biblioteca de expressão de cotilédones de soja. A seqüência de aminoácidos deduzida da proteína S-64 apresenta 85% de identidade com a proteína de ligação à sacarose (SBP), um provável sinal, um sítio consenso de glicosilação e um sítio consenso de ligação à ATP/GTP. Nessa investigação, uma versão truncada da proteína S-64 foi expressa em E. coli e a proteína recombinante purificada, utilizada em ensaios de caracterização bioquímica. Além da alta conservação de seqüência com SBP, o fracionamento subcelular de cotilédones demonstrou que a proteína S-64 está associada a membranas. Consistente com sua localização subcelular, o terminal amino hidrofóbico da proteína parece ter função de Peptídeo sinal, uma vez que a proteína intacta não foi acumulada em E. coli, ao passo que a proteína S-64 isenta do Peptídeo sinal foi eficientemente sintetizada em bactéria. Provavelmente, o sistema de secreção da E. coli reconheceu o terminal hidrofóbico da proteína intacta, e a proteína recombinante foi secretada e degradada. No entanto, tradução in vitro do RNA sintético de S-64 usando reticulócitos de coelho, na presença de membranas microssomais pancreáticas caninas, demonstrou que o Peptídeo sinal de S-64 não é clivado. Tal resultado indicou que a proteína S-64 é uma proteína de membrana do tipo II, e o seu terminal amino apresenta as funções de Peptídeo sinal, endereçando a proteína para o retículo endoplasmático; e domínio transmembrana, fixando a proteína na membrana plasmática. A capacidade de S-64 oligomerizar foi avaliada em géis semidesnaturantes e o seu domínio de oligomerização mapeado, correspondente aos aminoácidos 36 a 343, usando-se versões truncadas da proteína. A possibilidade de a proteína ligar-se à GTP por meio do seu sítio consenso de ligação a nucleotídeos foi determinada por “GTP dot blot”. A proteína S-64 liga-se à GTP, preferencialmente à ATP, uma vez que uma versão de S-64 produzida em E. coli foi marcada radioativamente por [ 32 Pα]-GTP, na presença de ATP não marcado como competidor. O sítio de ligação à GTP foi delimitado pelo teste de perda de função a partir de mutação dirigida in situ. De fato, mutação no putativo sítio de ligação a ATP/GTP bloqueia a referida atividade da proteína. Tais resultados estabelecem que a proteína S-64 é, de fato, uma proteína de ligação à GTP associada à membrana. A atividade de ligação à GTP da proteína pode estar envolvida na regulação da função da proteína como transportadora de sacarose.
Caracterização cinética da isocitrato desidrogenase de mitocôndrias de batata e de soja
(Universidade Federal de Viçosa, 1999-07-28) Borges, Regis; Silva, Marco Aurélio Pedron e; http://lattes.cnpq.br/9673696798282013
Este trabalho teve por objetivo avaliar a regulação da atividade da isocitrato desidrogenase dependente de NAD + (NAD + -IDH), por cátions divalentes e nucleotídeos de adenina, em mitocôndrias vegetais. Para isto, utilizaram-se extratos enzimáticos de mitocôndrias isoladas de hipocótilos e raízes de soja e de tubérculos de batata, tendo a atividade da enzima sido determinada, espectrofotometricamente, pela redução do NAD + a 340 nm. A NAD + -IDH, independente da fonte da enzima, apresentou atividade ótima em pH 7,5 e temperatura de 35 o C. O armazenamento em banho de gelo ocasionou perda progressiva de atividade enzimática, semelhante para os materiais utilizados. A -20 o C, a enzima extraída de soja mostrou maior estabilidade, em função do tempo, que a de tubérculos de batata. Os cátions Mn 2+ e Mg 2+ estimularam a atividade da enzima, além de reverterem os efeitos do EGTA, porém, o Ca 2+ não teve as mesmas influências. Houve pequena diminuição da atividade enzimática em presença do ADP e uma diminuição da atividade enzimática mais drástica em resposta ao ATP, independente da fonte da enzima. O cálcio não interferiu no efeito dos nucleotídeos de adenina. Os valores de K M app e V máx app aparentes não foram alterados pelo cálcio. Em média, os valores de K M app foram em torno de 0,10 mM. Para as mitocôndrias de batata V máx app foi de 28 nm min -1 e para soja, em torno de 13 nm min -1 . Os dados não permitem associar a capacidade de mitocôndrias em acumular Ca 2+ com um possível controle diferencial deste cátion sobre a atividade da isocitrato desidrogenase dependente de NAD + .
Caracterização do gene de SBP2 (Sucrose Binding Protein) de soja em plantas transgênicas de tabaco: análise funcional da proteína e atividade do promotor SBP2
(Universidade Federal de Viçosa, 2005-05-24) Waclawovsky, Alessandro Jaquiel; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/7917466639435802
Em plantas, a energia luminosa é transformada em energia química na forma de carboidratos, os quais são alocados entre os diferentes tecidos vegetais através do floema. Durante este processo, a sacarose, principal carboidrato transportado em plantas superiores, é “carregada” e “descarregada” no floema com o auxílio de transportadores localizados na membrana plasmática. A proteína SBP (“sucrose binding protein”) foi inicialmente identificada pela sua capacidade em ligar a sacarose e, pelo menos, dois homólogos da proteína, SBP1 e SBP2, têm sido descritos em soja. Neste trabalho, nós analisamos a função de SBP2 em plantas transgênicas de tabaco expressando o cDNA na orientação antisenso e caracterizamos os cis-elementos presentes no promotor que controlam a expressão espacial do gene SBP. Plantas anti- senso na geração T2 apresentaram crescimento e desenvolvimento reduzidos. Este fenótipo, característico de plantas com inibição do transporte de sacarose a longa distância, foi associado a alterações fisiológicas e metabólicas ocorridas, principalmente, na fase vegetativa do desenvolvimento. As plantas apresentaram reduzida fotossíntese e alteração no particionamento de carboidratos, com preferência para o acúmulo de amido nas folhas em detrimento à síntese de sacarose. Nossos dados suportam a hipótese que SBP provavelmente atua no transporte de sacarose a longa distancia no floema, alterando a expressão ou a atividade de proteínas envolvidas em sistemas alternativos de transporte de carboidratos, já que a manipulação dos níveis de SBP também alterou a atividade da invertase e da sintase da sacarose. Consistente com o papel da proteína no transporte de sacarose, um fragmento de 2 kb do promotor de SBP2 dirigiu a expressão do gene repórter de β- glicuronidase (GUS) para as células do floema de folhas, caules e raízes. A caracterização dos cis-elementos presentes no promotor de SBP2 foi realizada por deleções sucessivas na região 5’ e por deleções internas. A deleção da seqüência de - 2000 a -703 causou o acúmulo de GUS em todos os tecidos de folhas, caule e raízes analisados, indicando a presença de cis-elementos que reprimem a atividade do promotor em tecidos, que não o floema, a jusante da posição -703 pb. Deleções sucessivas até a posição -92 indicaram que a atividade tecido-específica do promotor é coordenada pela interação complexa entre elementos negativos e positivos. De fato, elementos negativos fortes foram identificados na seqüência delimitada pelas posições -495 e -370, os quais foram confirmados por experimentos de ganho de função, e também, entre -243 e -193. Foi identificada também uma região silenciadora do meristema radicular na região entre -136 e -92. Uma seqüência curta de 92pb a partir do códon de iniciação de tradução foi capaz de manter altos níveis de expressão basal em todos os tecidos analisados e, portanto, provavelmente representa um promotor eucariótico mínimo em plantas.
Caracterização fisiológica e metabólica de folhas de cultivares de cana de açúcar contrastantes para tolerância à seca
(Universidade Federal de Viçosa, 2012-11-21) Soares, Eduardo de Almeida; Loureiro, Marcelo Ehlers; http://lattes.cnpq.br/8659607598772430
O estresse hídrico é um dos estresses de maior importância na produtividade das plantas. Objetivando fornecer evidências de possíveis mecanismos de tolerância à seca, no presente trabalho caracterizou-se a fisiologia e o metabolismo de folhas de plantas de cana de açúcar, de cultivares contrastantes para a tolerância à seca. Para tal, plantas das cultivares RB867515 e RB855536, com características de tolerância e sensibilidade, respectivamente, foram crescidas em vasos de 30L até aproximadamente 50 cm de altura, quando foram submetidas aos potenciais hídricos de 0 MPa (controle), -0,5 MPa (défice moderado) e -1 MPa (défice severo). A cultivar tolerante apresentou retardamento da desidratação foliar com redução da condutância estomática e maior eficiência do uso da água sob estresse hídrico severo, momento no qual observou-se uma inibição bioquímica da fotossíntese semelhante entre genótipos, como pode ser deduzido do aumento da razão Ci/Ca e A/Ci. O menor dano oxidativo no cultivar tolerante pode ser inferido pela presença de menor extravasamento de eletrólitos, mas o teor de MDA foi semelhante entre as duas cultivares nos dois níveis de estresse. Os dados de fluorescência da clorofila a permitem sugerir que a cultivar tolerante pode apresentar mais fotodanos na presença de estresse hídrico, visto que esta possui maior redução do rendimento quântico máximo potencial do FSII (Fv/Fm), maior elevação na fluorescência mínima em folhas adaptadas ao escuro (Fo), e menor coeficiente de extinção não fotoquímico (qN). O fato de não haver diferenças no rendimento quântico da conversão fotoquímica da energia no fotossistema II (ΦII ) indica que o genótipo tolerante compensou o menor Φ NPQ (rendimento quântico de dissipação de energia regulada) com um maior ΦNO (rendimento quântico de perda de energia não regulada do FSII). O maior ΦNO pode ser um mecanismo que contribui para a tolerância à seca, visto que pode ajudar a reduzir a formação de clorofilas e a produção de radicais livres e espécies reativas de oxigênio. Alterações no metabolismo sugerem um papel da osmorregulação no mecanismo de tolerância à seca, visto que a variedade tolerante apresentou maiores níveis de malato e aminoácidos livres sob estresse moderado e maiores níveis de glicose, frutose, malato e aminoácidos sob estresse severo. Foi possível observar um aumento em cerca de 10X nos níveis de ABA foliar em ambos os genótipos sob estresse moderado, mas sob estresse hídrico severo, estes altos níveis são mantidos somente no genótipo tolerante. Os resultados permitiram observar que a maior tolerância à seca observada a campo para a variedade RB 867515 também pode ser observada em pequenos vasos, onde a taxa de imposição do défice hídrico é muito mais rápida do que em condições naturais. Entre os fenótipos de tolerância, concluímos que a composição isotópica seria o método de seleção mais apropriado para selecionar progênies portadoras de tolerância à seca.
Caracterização funcional da proteína BiP de soja induzida por estresse osmótico e déficit hídrico
(Universidade Federal de Viçosa, 2001-12-28) Carolino, Sônia Madali Boseja; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/4252852403677230
O chaperone molecular residente do retículo endoplasmático (RE), denominado BiP “Binding Protein”, é membro da classe Hsp70 de proteína de estresse, sendo regulado em resposta a condições de estresse do RE, como acúmulo de proteínas desdobradas e desequilíbrio na homeostase de cálcio. Em condições normais, BiP de mamíferos sofre fosforilação e oligomerização. As modificações de BiP de mamíferos são restritas à forma oligomérica, sendo que a forma monomérica inalterada representa a espécie ativa. Recentemente, foi demonstrado que BiP de soja existe como formas fosforiladas e desfosforiladas interconversíveis, e o equilíbrio pode ser deslocado em qualquer direção em respostas a diferentes estímulos. Em contraste com o tratamento com tunicamicina, o estresse osmótico estimula a fosforilação das espécies de BiP em cultura de células de soja. Nesta investigação foi demonstrado que, independentemente do seu estado de oligomerização, as isoformas de BiP de folhas, sob déficit hídrico, exibem atividade de ligação a proteínas, indicando que a regulação de BiP de plantas pode diferir de outros eucariotos. Foi também caracterizado o estado de oligomerização das isoformas de BiP de soja induzidas por estresse osmótico e tunicamicina. Assim como em células de mamíferos, tanto a forma oligomérica como a monomérica foram detectadas em células de soja não-estressadas. A desfosforilação de BiP mediada por tunicamicina é acompanhada pela conversão da forma oligomérica para a monomérica. Entretanto, a forma fosforilada de BiP induzida por estresse osmótico existe predominantemente como espécie monomérica. Esses resultados indicam que a fosforilação de BiP induzida por estresse osmótico não media a oligomerização da proteína, e pode ter uma função regulatória distinta. A função protetora de BiP em planta foi examinada em condições de estresse hídrico. Plantas transgênicas de Nicotiana tabacum expressando constitutivamente níveis elevados de BiP ou seu cDNA anti-senso foram sujeitas à condição de déficit hídrico progressivo. Elevados níveis de BiP nas linhagens senso conferiram tolerância ao déficit hídrico durante o crescimento das plantas. Sob seca progressiva, os níveis de BiP foliar correlacionaram com a manutenção da turgescência celular e com o conteúdo de água da parte aérea. O efeito protetor da superexpressão de BiP contra estresse hídrico foi anulado pela repressão anti-senso. Embora a superexpressão de BiP previna a desidratação celular, a condutância estomática e a taxa transpiratória em folhas senso estressadas foram superiores em relação às folhas controles e anti-senso. Em plantas anti-senso, a indução do sistema de defesa antioxidativo foi maior do que nas plantas controle, enquanto que em folhas senso estressadas a indução da atividade da superóxido dismutase não foi observada. Coletivamente, esses resultados evidenciam que a superexpressão de BiP em plantas pode conferir tolerância à seca, prevenindo o estresse oxidativo endógeno.
Caracterização molecular de genes que codificam a proteína BiP de soja e análise funcional de seus promotores
(Universidade Federal de Viçosa, 2001-08-09) Buzeli, Reginaldo Aparecido Alves; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista
A proteína BiP (Binding Protein) está envolvida no dobramento correto de proteínas secretórias e retenção no RE de proteínas dobradas ou montadas incorretamente. BiP também atua auxiliando na solubilização de agregados protéicos durante períodos de estresses. Dois clones de BiP de soja, denominados gsBiP6 e gsBiP9, foram isolados a partir das bibliotecas genômicas provenientes dos fagos λEMBL3 e λZAP II, respectivamente. Os promotores de gsBiP6 e gsBiP9 possuem cis-elementos gerais, característicos de promotores de genes de plantas, como as seqüências de transcrição CAAT e TATA, e cis-elementos que respondem a estresses do retículo endoplasmático (ERSE), além de elementos G-box. Os promotores de BiP foram fusionados ao gene repórter gus e usados para transformar Nicotiana tabacum via A. tumefaciens. Análises histoquímicas de plantas transformadas com as construções -358pbip6-gus ou -2200pbip9-gus revelaram que os promotores de BiP produziram um padrão uniforme de expressão de GUS em folhas, caules e raízes. Intensa atividade histoquímica de GUS foi observada nos feixes vasculares de folhas, caule e raízes e em regiões de traço foliar, assim como, no meristema apical, local onde ocorre intensa divisão celular. Este padrão de distribuição espacial da atividade de GUS sugere estar correlacionado com uma expressão desses genes em tecidos que apresentam alta atividade celular secretória e alta proporção de células em um processo ativo de divisão celular. Coerente com esta observação, a atividade histoquímica de GUS é muito menos intensa no parênquima xilemático. Deleções do promotor de gsBiP6 foram conduzidas na orientação 5’-3’ (- 138pbip6-gus) e no interior do clone Δ(-226/-82)pbip6-gus. Análise dessas deleções em plantas transformadas, identificaram 2 domínios regulatórios cis-atuantes, denominados CRD1 (-358 a -226) e CRD2 (-226 a -82). A região CRD1 exibe atividade de enhancer, já que foi capaz de restaurar altos níveis de expressão basal do gene repórter gus, quando ligada à extremidade 5’ na posição -82 do promotor de BiP6. A região CRD2 contém tanto cis -elementos regulatórios positivos quanto cis -elementos negativos que contribuem para o padrão tecido-específico de expressão controlado pelo promotor de gsBiP6. A expressão do gene repórter na região do procâmbio em raízes, no meristema apical e no floema de caule foi absolutamente dependente da região CRD2. Em contraste, deleção de CRD2 resultou em acúmulo acentuado de atividade de GUS no parênquima xilemático. A ativação dos promotores BiP6 e BiP9 em resposta ao acúmulo de proteínas anormais no retículo endoplasmático (UPR) e em respostas a estresse osmótico foi avaliada em discos foliares transgênicos. Tratamento dos discos foliares com tunicamicina, ativador da via UPR, e com PEG, indutor de um estresse osmótico, induziu a expressão de GUS, sob o controle do pro motor BiP6 e do promotor BiP9. A deleção da região CRD2 (-226 a -82) no promotor BiP6 causou a perda da inducibilidade da expressão gênica em resposta a tunicamicina e PEG, indicando que CRD2 contém elementos cis-atuantes de resposta a estresse. De fato, dois cis-elementos conservados atuantes na via UPR (UPRE) foram identificados na região CRD2. Coletivamente, estes resultados sugerem que o controle da expressão de BiP em plantas depende de uma complexa integração de múltiplos cis-elementos regulatórios no promotor.
Cinética da fluorescência e atividade do sistema antioxidativo em plantas de eucalipto com micorrizas sob temperatura supra-ótima
(Universidade Federal de Viçosa, 1998-11-27) Tótola, Marcos Rogério; Borges, Arnaldo Chaer; http://lattes.cnpq.br/4086846335875092
Plantas de Eucalyptus grandis foram aclimatadas a 25 o C e 400 μmol fótons m -2 s -1 , em câmara de crescimento, e posteriormente submetidas a uma combinação de temperatura e irradiância supra-ótimas, 40 o C e 1.200 μmol fótons m -2 s -1 , a fim de se avaliarem as respostas fisiológicas dessa espécie a uma condição potencialmente fotoinibitória. Não se observaram efeitos isolados da temperatura ou do excesso de irradiância sobre a eficiência fotoquímica do Fotossistema II (FS II), avaliada como a razão entre a fluorescência variável e a fluorescência máxima (F v /F m ), porém observou-se um efeito sinérgico desses dois fatores. A redução de F v /F m foi atribuída, primariamente, à redução da fluorescência máxima (F m ). A pré-aclimatação dos discos foliares à temperatura de 35 o C e baixa irradiância, 5 μmol fótons m -2 s -1 , por duas horas, resultou em aumento da tolerância à condição fotoinibitória. Pode-se inferir que a aquisição de tolerância à fotoinibição do PS II de E. grandis envolveu, primariamente, a alteração conformacional do centro de reação do PS II. Não se pode descartar o envolvimento da síntese de novo de proteínas neste processo, em razão do tempo requerido para se observar a alteração. O funcionamento de alguns componentes do sistema antioxidativo foi avaliado no sistema Eucalyptus-Pisolithus, em resposta à elevação da temperatura de 25 o C-28 o C para 40 o C. As alterações nas atividades de catalase (Cat), peroxidases não-específicas (Pod) e superóxido dismutase (Sod), em dois isolados fúngicos, traduziram estratégias diferentes de regulação do sistema antioxidativo. Houve reduções significativas nas atividades específicas da Cat, das Pod e da ascorbato peroxidase (AscPod), da atividade total da Sod e do teor de proteínas solúveis em folhas de E. grandis, após incubação a 40 o C. Essas alterações refletiram no menor teor de clorofila a e no aumento do teor de malondialdeído, uma indicação de que houve peroxidação de lipídios. Em raízes, não se observou efeito significativo da temperatura sobre as atividades de Cat, Pod e Sod. Não se detectou atividade da AscPod nesse órgão. Houve redução significativa do teor de proteínas solúveis e aumento do teor de malondialdeído após incubação a 40 o C, por três horas. As relações Sod:Cat e Sod:Pod nas micorrizas seguiram o padrão de aumento ou de redução observado no micélio dos dois isolados fúngicos. A atividade total da Sod foi maior do que nas raízes, a despeito da sua menor atividade nos micélios fúngicos. Este aumento resultou da indução de 4 a 5 novas isoenzimas de Sod do tipo Mn-Sod, todas de baixo peso molecular e com possível origem fúngica. O conjunto dos resultados obtidos permite inferir que o controle do sistema antioxidativo é exercido de forma mais eficiente nas micorrizas do que nos componentes individuais da associação mutualista. Este controle pode ser um dos responsáveis pelo benefício mútuo decorrente da associação simbiótica, especialmente observado em condições ambientais pouco favoráveis à sobrevivência dos organismos que dela participam.
Determinantes fisiológicos e moleculares da resposta diferencial à seca em soja
(Universidade Federal de Viçosa, 2013-04-16) Mesquita, Rosilene Oliveira; Loureiro, Marcelo Ehlers; http://lattes.cnpq.br/5159843923658602
O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar fisiologicamente e identificar proteínas diferencialmente expressas e fosforiladas em raízes de genótipos de soja contrastantes para tolerância à seca, sendo um tolerante (Embrapa 48) e um sensível (BR 16), de forma a melhor entender os mecanismos de resposta e identificar proteínas candidatas no desenvolvimento de estratégias para aumento da tolerância à seca. As plantas foram avaliadas em condições de plena irrigação (controle) e sob déficit hídrico imposto pela suspensão da irrigação até que as plantas atingissem os potenciais hídricos na antemanhã (Ψam) de -1,0 MPa (moderado) e -1,5 MPa (severo). As análises fisiológicas mostraram que esses cultivares exibem mecanismos diferenciais em resposta ao déficit hídrico. O cultivar Embrapa 48 retardou a desidratação em dois dias, mantendo A, ETR e ΦPSII maior mesmo sob déficit. Este resultado não foi relacionado a alterações na gs ou na composição isotópica do 13C, sugerindo a importância na condutividade hidráulica nesta tolerância, e a uma maior indução do crescimento radicular sob deficiência hídrica. Além disso, em folhas, apresentou menor dano oxidativo e a análise de perfil metabólico evidenciou um maior ajuste osmótico pelo acúmulo de açúcares e aminoácidos. Nas raízes, apresentou maior acúmulo de ácidos orgânicos, intermediários da glicólise e Ciclo de Krebs, além de aminoácidos. O cultivar tolerante também apresentou maiores níveis foliares e radiculares de ABA. Houve uma manutenção do crescimento radicular no tolerante e redução do crescimento relativo da parte aérea. A enxertia recíproca confirmou a importância da condutividade hidráulica no mecanismo de tolerância do genótipo tolerante, indicando o sistema radicular como um dos principais fatores que contribuem para a maior tolerância nesse cultivar. As proteínas diferencialmente expressas e fosfoproteínas foram analisadas através de 2D-SDS PAGE e detectadas com CCB (proteínas diferenciais) e Pro-Q DPS (proteínas fosforiladas) associadas a identificação por MS. A análise diferencial das proteínas de raízes revelou mecanismos de tolerância ao déficit hídrico relacionado aos mecanismos de respiração, metabolismo antioxidativo, metabolismo secundário e metabolismo de aminoácidos, entrando em conformidade com as diferenças encontradas no perfil metabólico. O fosfoproteoma apresentou uma correlação com o proteoma diferencial na ausência e na presença de déficit severo com muitas proteínas comuns às duas abordagens. A respiração foi o grupo cuja fosforilação foi fortemente afetada em resposta à seca, sendo representada por 12 proteínas. Adicionalmente, várias enzimas da respiração, síntese de aminoácidos e mecanismo antioxidativo, tiveram aumento em sua fosforilação sem apresentar alterações em sua abundancia, providenciando mais evidencias para a resposta diferencial da respiração na tolerância a seca em soja. A análise conjunta somente no genótipo tolerante permitiu observar que o aumento da fosforilação de uma proteína pode ser transiente com o estresse. Os resultados também sugerem um papel adicional do ABA na resposta ao estresse hídrico, induzindo cascatas cinases e aumentando a respiração para permitir a menor redução crescimento radicular em resposta a seca, o que poderia explicar o maior volume radicular observado no cultivar tolerante sob seca. A fosforilação participa nas características do proteoma com maiores níveis na abundancia e na fosforilação em muitas proteínas no tolerante. Estes resultados reforçam a visão de que a tolerância à seca é uma herança quantitativa, onde vários mecanismos estão envolvidos.
Efeito da temperatura e de inibidores da ação do etileno na longevidade de flores de esporinha (Consolida ajacis Nieuwl.)
(Universidade Federal de Viçosa, 2003-04-14) Santos, Vanessa Rebouças; Finger, Fernando Luiz; http://lattes.cnpq.br/9782949272653296
O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da temperatura e de inibidores da ação do etileno sobre a longevidade, abscisão, produção de CO 2 e etileno nas inflorescências de esporinha (Consolida ajacis Nieuwl.). As flores foram padronizadas em tamanho e distribuídas ao acaso nos seguintes experimentos: 1, mantidas em água destilada nas câmaras com temperatura controlada em 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40 oC. 2, tratadas com 1-MCP (1- metilciclopropeno), inibidor da ação do etileno, na concentração 0,125; 0,25; 0,5; 1,0 e 1,5 g m -3 de Ethylbloc (produto comercial), que corresponde a 175; 350; 700; 1400 e 2100 ng L -1 de 1-MCP, por 6 horas em câmaras lacradas; 3, mantidas em solução de ‘pulsing’ com 1mM de TSP (tiosulfato de prata), inibidor da ação do etileno, por (30 minutos); 4, ‘pulsing’ com sacarose (5%), por 6 horas; 5, ‘pulsing’ com 1mM de TSP, por 30 minutos combinado com sacarose (5%) por 6 horas; 6, aplicação de 1-MCP (0,5 g m -3 de Ethylbloc) em câmaras lacradas, durante 6 horas e controle; 7, pulverização de 30 em 30 minutos com solução de Ethrel à concentração 0,1; 1; 10; 100 e 1000 mg L -1 ; 8- pulverizadas com Ethrel (100 mg L -1 ) antes e/ou depois do tratamento com 1- MCP (0,5 gm -3 de Ethylbloc), durante 6 horas. Após, todos tratamentos as inflorescências foram transferidas para vasos contendo água destilada. Diariamente registrou-se a abscisão e o murchamento das flores e pétalas; a longevidade baseou-se no critério de 50% de abscisão ou murchamento das flores. A temperatura afetou diretamente a longevidade das flores; com a elevação ocorreu redução na vida em vaso das inflorescências. O tratamento com TSP foi o mais eficaz para prolongar a longevidade, seguido do tratamento com TSP em combinação com sacarose (5%). A sacarose aplicada isoladamente em ‘pulsing’ não teve efeito na manutenção da qualidade das inflorescências. O 1-MCP não foi tão eficiente em relação aos tratamentos que continham TSP na sua formulação, mas possibilitou resultados positivos em relação ao controle ou tratamento com sacarose. O 1-MCP foi eficaz em reverter à ação do etileno, aplicado antes ou depois do tratamento com Ethrel.