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Caracterização de linhagens recombinantes de Penicillium griseoroseum: análise do cariótipo, da expressão dos genes plg 1 e pgg 2 e da produção de pectina liase e poligalacturonase em resposta ao pH do meio
(Universidade Federal de Viçosa, 2011-05-23) Teixeira, Janaina Aparecida; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; http://lattes.cnpq.br/7776451670494630; Tótola, Marcos Rogério; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727020U4; Castro, Ieso de Miranda; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787281A9; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/7361036485940798
Os estudos genéticos e fisiológicos realizados com o isolado Penicillium griseoroseum CCT6421 ressaltam as vantagens para a sua aplicação como hospedeiro para produção de proteínas. A obtenção e análise de linhagens recombinantes de P. griseoroseum com alta produção de pectina liase (PL) e poligalacturonase (PG) evidenciaram o eficiente sistema de secreção desse fungo, indicando a possibilidade de utilização deste como plataforma para produção de proteínas de interesse industrial. Entretanto, pouco é conhecido sobre a organização do genoma de P. griseoroseum e das linhagens recombinantes. Neste trabalho foi estimado o tamanho do genoma de P. griseoroseum entre 29,8 e 31,0 Mb, distribuídos em quatro cromossomos. O gene plg1, que codifica PL, está em cópia única no genoma de P. griseoroseum e foi localizado no cromossomo II (9,22 Mb). A linhagem recombinante T105, que possui cópias adicionais do gene plg1 sob controle do promotor de gpd de Aspergillus nidulans, apresentou integrações nos cromossomos II, III e IV. As linhagens recombinantes T146 e T20 possuem, respectivamente, cópias adicionais do gene pgg2 e dos genes pgg2 e plg1, sob o controle do promotor de gpd de A. nidulans. O gene pgg2 codifica PG em P. griseoroseum. A análise da expressão dos genes plg1 e pgg2, nas linhagens recombinantes de P. griseoroseum multi-cópias, mostrou que o aumento do número de cópias dos genes proporciona o aumento da produção enzimática. Uma cópia do gene plg1, sob o controle do promotor constitutivo, proporcionou um aumento de 200 vezes na expressão em relação ao gene endógeno e duas cópias do gene pgg2, também sob o controle do promotor constitutivo, proporcionaram um aumento de 1100 vezes na expressão em relação ao gene endógeno. A produção e secreção de PL e PG pelas linhagens recombinantes T105, T146 e T20 de P. griseoroseum são afetadas pelas condições de cultivo. As linhagens foram cultivadas em meio tamponado MMT (pH 6,8) e em meio não-tamponado MMNT (pH 6,3 3,0), para verificar a expressão dos genes plg1 e pgg2, produção e secreção de PL e PG em diferentes tempos de cultivo. A transcrição dos genes plg1 e pgg2, nas linhagens recombinantes, é constitutiva e não foi detectado variação em ambos os meios. No entanto, a quantidade de proteína total secretada variou em média 7,8 ± 1,1 μg/mL no meio MMT e 3,25 ± 1,50 μg/mL no meio MMNT. A análise por SDS-PAGE das proteínas do sobrenadante da cultura das linhagens possibilitou verificar uma maior quantidade de PL e PG secretada no meio MMT do que no meio MMNT. A secreção de PL e de PG foram afetadas pela variação do pH do meio, apresentando reduções nas atividades de 6,4 e 3,6 vezes, respectivamente, para a atividade detectada em meio MMNT em comparação ao meio MMT. A variação do pH do meio também alterou a morfologia da hifa e do micélio da linhagem recombinante T20, o que pode estar relacionado com a redução da secreção de PL e PG. Os resultados mostram que a maquinaria de transcrição, tradução e secreção de proteínas do fungo P. griseoroseum responde ao aumento do número de cópias de genes no genoma, observando-se as condições de cultivo.
Genome organization and assessment of high copy number and increased expression of pectinolytic genes from Penicillium griseoroseum: a potential heterologous system for protein production
(Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2014-01-08) Teixeira, Janaina Aparecida; Nogueira, Guilherme Bicalho; Queiroz, Marisa Vieira de; Araújo, Elza Fernandes de
The fungus Penicillium griseoroseum has the potential for application on an industrial scale as a host for the production of homologous and heterologous proteins, mainly because it does not produce some mycotoxins or secrete proteases under the growth conditions for pectinase production. However, for the fungus to be used effectively as an expression heterologous system, an understanding of the organization of its genome, as well as the mechanisms of gene expression and protein production, is required. In the present study, the size of the P. griseoroseum genome was estimated to be 29.8–31.5 Mb, distributed among four chromosomes. An analysis of plg1 and pgg2 pectinolytic genes expression and copy number in recombinant multi-copy strains of P. griseoroseum demonstrated that an increase in the number of gene copies could increase enzyme production, but the transcription could be affected by the gene integration position. Placing a copy of the plg1 gene under the control of the gpd promoter of Aspergillus nidulans yielded a 200-fold increase in transcription levels compared to the endogenous gene, and two copies of the pgg2 gene produced an 1100-fold increase compared with the endogenous gene. These results demonstrated that transcription, translation, and protein secretion in the fungus P. griseoroseum respond to an increased number of gene copies in the genome. The processing capacity and efficiency of protein secretion in P. griseoroseum are consistent with our premise that this fungus can be used for the industrial-scale production of several enzymes.
The minimal regulatory region necessary for the expression of the Penicillium griseoroseum plg1 gene
(Annals of Microbiology, 2015-06) Bazzolli, Denise Mara Soares; Reis, Klédna Constância Portes; Teixeira, Janaina Aparecida; Ribon, Andréa Oliveira Barros; Queiroz, Marisa Vieira de; Araújo, Elza Fernandes de
The expression of the Penicillium griseoroseum plg1 gene is induced by citric pectin and repressed by glucose. In this work, the minimal region of the plg1 gene promoter essential for expression in pectin and sucrose plus yeast extract was identified by using constructs containing the gfp ORF under control of the plg1 gene promoter. The fragment A (283 bp) is essential for plg1 expression in sucrose plus yeast extract. Fragment B (309 bp plus 184; core promoter) was critical for expression in pectin and abolished the catabolic repression by glucose. Therefore, the fragment of 776 bp (fragment A and B) is essential for the expression of the plg1 gene in natural inducing conditions (pectin as carbon source) and in sucrose plus yeast extract. The fragment B is a promising minimal promoter usable for heterologous expression in filamentous fungi, since genes that contain it could be activated by the presence of peel from citric fruits (which contains citric pectin) and are not affected by glucose in these agricultural by-products.
Obtenção e caracterização de linhagens recombinantes de Penicillium griseoroseum com alta produção de pectina liase e poligalacturonase
(Universidade Federal de Viçosa, 2007-03-12) Teixeira, Janaina Aparecida; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; http://lattes.cnpq.br/7776451670494630; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Tótola, Marcos Rogério; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727020U4
Penicillium griseoroseum foi descrita como uma espécie promissora para a produção de poligalacturonase (PG) e pectina liase (PL). No entanto, os genes que codificam estas enzimas em P. griseoroseum requerem indução por pectina e sofrem repressão catabólica na presença de glicose. Uma estratégia para aumentar a expressão destes genes é a substituição do promotor endógeno por um promotor forte e constitutivo. Desse modo, para se obter linhagens com alta produção de poligalacturonase e pectina liase, sem a necessidade de indução, foi feita a co-transformação da linhagem recombinante 105, que possui cópias adicionais do gene plg1 sob controle do promotor do gene gpd de A. nidulans, utilizando-se os plasmídeos pAN52pgg2 e pAN7.1. As linhagens recombinantes obtidas apresentaram, pelo menos, uma cópia do pAN52pgg2 integrada no genoma. A linhagem mitoticamente estável, denominada recombinante R20 de P. griseoroseum, foi selecionada por apresentar a maior produção de PG e PL em comparação com as demais linhagens recombinantes obtidas. Esta linhagem apresentou uma elevada produção de poligalacturonase e pectina liase, quando cultivada em presença de glicose, sacarose ou caldo de cana. Aumentos de 11 vezes na atividade de PG e de 45 vezes na atividade de PL ocorreram, quando a linhagem recombinante R20 foi cultivada em caldo de cana, em relação à linhagem selvagem cultivada em condições ótimas de produção. A maior produção de PG, PL e massa micelial seca pela linhagem recombinante R20 foi obtida, quando se utilizou inóculo de 106 conídios/mL, concentração de glicose 1% (p/v), volume de 200 mL de meio de cultivo em Erlenmeyers de 500 mL e tempo de cultivo de 72 a 96 horas, sob agitação de 150 RPM a 25ºC. No perfil protéico da linhagem recombinante R20 evidenciou-se a presença de duas bandas de proteínas distintas com aproximadamente 38 e 36 kDa, que correspondem a PG e a PL, respectivamente. A linhagem apresentou baixa atividade de protease no período final de cultivo, enquanto a atividade celulolítica não foi detectada nas condições avaliadas. Além disso, a linhagem recombinante R20 teve uma secreção de 18 mg de proteína total/L em 120 horas de cultivo, sendo pectina liase e poligalacturonase preferencialmente secretadas. Os resultados são úteis para a condução de experimentos de otimização em larga escala e posterior aplicação da linhagem recombinante R20 na indústria de produção de pectinases.
Overexpression of the plg1 gene encoding pectin lyase in Penicillium griseoroseum
(Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2007-11-12) Teixeira, Janaina Aparecida; Ribeiro, João Batista; Teixeira, Janaina Aparecida; Queiroz, Marisa Vieira de; Araújo, Elza Fernandes de
The pectin lyase (PL) is an industrially important enzyme since it is used for maceration and clarification in the process of fruit juice production in food industries. In order to increase the yields of pectin lyase we cloned the plg1 (pectin lyase 1) from Penicillium griseoroseum gene under the control of the strong constitutive promoter of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (gpdA) and the terminator region of the tryptophan synthetase (trpC) gene from Aspergillus nidulans (plasmid pAN52-Plg1) and transformed this construct into the P. griseoroseum strain PG63. One of the pAN52-Plg1 multi-copy transformants (strain 105) grown in culture medium containing glucose or sugar cane juice showed PL activities of 4,804 or 5,202 U ml−1 respectively, which represented 57- and 132-fold increases. In addition, the apparent specific activity of PL produced by this strain was much higher than the one observed for a commercial pectinase preparation. Evaluation of the extracellular proteins in the culture supernatant of strain 105 by SDS-PAGE showed the presence of a clear and strong band of approximately 40 kDa that probably corresponds to PL. The enzyme yields reported here demonstrate that the system we developed is able to express pectin lyase at levels comparable to, or exceeding, previously reported data.
Overproduction of polygalacturonase by Penicillium griseoroseum recombinant strains and functional analysis by targeted disruption of the pgg2 Gene
(Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013-01-14) Teixeira, Janaina Aparecida; Ribeiro, João Batista; Gonçalves, Daniel Bonoto; Queiroz, Marisa Vieira de; Araújo, Elza Fernandes de
Inactivation of the pgg2 gene, a polygalacturonase-encoding gene from Penicillium griseoroseum, reduced the total activity of polygalacturonase (PG) by 90 % in wild-type P. griseoroseum, which indicates that the pgg2 gene is the major gene responsible for PG production in this species. To increase PG production, the coding region of the pgg2 gene was cloned under the control of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (gpd) promoter and the terminator region of the tryptophan synthase (trpC) gene from Aspergillus nidulans (pAN52pgg2 vector). This vector was then used to transform P. griseoroseum. The transformed strains were characterized according to PG production using glucose, sucrose, or sugar cane juice as the carbon sources. The recombinant P. griseoroseum T146 strain contained an additional copy of the pgg2 gene, which resulted in a 12-fold increase in PG activity when compared with that detected in the supernatant of the control PG63 strain. The proteins secreted by the recombinant strain T146 showed a strong band at 38 kDa, which corresponds to the molecular weight of PG of the P. griseoroseum. The results demonstrate the significant biotechnological potential of recombinant P. griseoroseum T146 for use in PG production.
Pectin lyase production by recombinant Penicillium griseoroseum strain 105
(Canadian Journal of Microbiology, 2010) Teixeira, Janaina Aparecida; Queiroz, Marisa Vieira de; Araújo, Elza Fernandes de; Cardoso, Patrícia Gomes
Recombinant Penicillium griseoroseum strain 105 overproduces an extracellular pectin lyase (PL) under the transcriptional control of the strong gpdA promoter of Aspergillus nidulans. Our aim was to evaluate PL production by recombinant P. griseoroseum strain 105 in submerged fermentation system bioreactors BioFloIII and BioFloIV using 2 or 10 L working volumes under different growth conditions and to analyze the production of cellulase, polygalacturonase, pectin methylesterase, and protease. PL overproduction by recombinant P. griseoroseum strain 105 was 112 times higher than that of P. griseoroseum PG63 grown in sugarcane juice. Cellulases and proteases were not detected in the culture filtrate, and evaluation for extracellular proteins in the culture medium by SDS–PAGE showed the presence of a 36 kDa predominant band, similar to the molecular mass estimated from the nucleotide sequence of plg1 gene for PL of P. griseoroseum strain 105. This recombinant strain provides the advantage of PL production, which predominates over other extracellular proteins usually present in most commercial pectinase preparations, using sugarcane juice as a substrate of low cost.