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Caracterização molecular e filogenética de dois genomovírus associados a plantas silvestres no Brasil
(Universidade Federal de Viçosa, 2017-02-24) Rezende, Rafael Reis de; Zerbini, Poliane Alfenas; http://lattes.cnpq.br/1345754571046369
Vírus que possuem genoma constituído por DNA fita simples circular são amplamente distribuídos na natureza. As constantes descobertas aliadas à grande diversidade genética desses vírus têm ampliado a compreensão sobre a trajetória evolutiva desse grupo. A partir de 2010 um grupo divergente de vírus com genoma de DNA fita simples circular, denominado genomovírus, passou a ser identificado em diversos ambientes (fezes e esgoto) e associados a diferentes organismos (plantas, fungos, humanos, mamíferos, moluscos e insetos). Neste trabalho foram caracterizados dois genomovírus denominados Momordica charantia associated gemycircularvirus (MorGemy) e Euphorbia heterophylla associated gemycircularvirus (EupGemy) encontrados associados às plantas silvestres Momordica charantia e Euphorbia heterophylla respectivamente. Ambos os vírus possuem organização genômica típica dos genomovírus. Ambos os vírus apresentam stem-loop com nanonucleotídeo conservado em todos os genomovírus, sendo a sequência TAATRTTAT (N pode ser A ou G). Entretanto, no isolado MorGemy foi observado uma estrutura em stem-loop extra na possível origem de replicação não presente em outros genomovírus já descritos. Em ambos os vírus foi observada a presença de um íntron, no interior da ORF que codifica a proteína Rep sendo que o íntron observado em EupGemy é maior que o observado em MorGemy. Na proteína Rep foram observados os motivos I, II e III, e os domínios Walker A, B, C e GRS, elementos encontrados tipicamente na proteína Rep dos geminivírus. O SDT (Sequence Demarcation Tool) revelou que MorGemy tem 72% de identidade com Pteropus associated gemycircularvirus 3 e Hypericum associated gemycircularvirus 1. Além disso, o EupGemy mostra 66% de identidade com Odonata asssociated gemycircularvirus 1. A taxa de identidade de nucleotídeos do genoma completo dos vírus isolados neste trabalho com outros genomovírus já descritos, permite classificar esses novos isolados como duas novas espécies.
Characterization of CRISPR-Cas systems in the Ralstonia solanacearum species complex
(Molecular Plant Pathology, 2019-02) Xavier, André da Silva; Almeida, Juliana Cristina Fraleon de; Melo, Alessandra Gonçalves de; Rousseau, Geneviève M.; Tremblay, Denise M.; Rezende, Rafael Reis de; Moineau, Sylvain; Alfenas‐Zerbini, Poliane
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) are composed of an array of short DNA repeat sequences separated by unique spacer sequences that are flanked by associated (Cas) genes. CRISPR-Cas systems are found in the genomes of several microbes and can act as an adaptive immune mechanism against invading foreign nucleic acids, such as phage genomes. Here, we studied the CRISPRCas systems in plant-pathogenic bacteria of the Ralstonia sola- nacearum species complex (RSSC). A CRISPR-Cas system was found in 31% of RSSC genomes present in public databases. Specifically, CRISPR-Cas types I-E and II-C were found, with I-E being the most common. The presence of the same CRISPRCas types in distinct Ralstonia phylotypes and species suggests the acquisition of the system by a common ancestor before Ralstonia species segregation. In addition, a Cas1 phylogeny (I-E type) showed a perfect geographical segregation of phylotypes, supporting an ancient acquisition. Ralstonia solanacearum strains CFBP2957 and K60 T were challenged with a virulent phage, and the CRISPR arrays of bacteriophage insensitive mutants (BIMs) were analysed. No new spacer acquisition was detected in the analysed BIMs. The functionality of the CRISPR-Cas interference step was also tested in R. solanacearum CFBP2957 using a spacer-protospacer adjacent motif (PAM) delivery system, and no resistance was observed against phage phiAP1. Our results show that the CRISPR-Cas system in R. solanacearum CFBP2957 is not its primary antiviral strategy.
Complete genome sequences of two gemycircularviruses associated with non-cultivated plants in Brazil
(Archives of Virology, 2018-11) Rezende, Rafael Reis de; Mar, Talita Bernardon; Páez, Lina Marcela Cortés; Xavier, André da Silva; Xavier, César Augusto Diniz; Zerbini, Francisco Murilo; Zerbini, Poliane Alfenas; Castillo, Jesús Navas
Gemycircularviruses (genus Gemycircularvirus, family Genomoviridae) are single-stranded DNA viruses that are spread around the world in association with several organisms and environments. In this work, we identified two gemycircularviruses associated with two non-cultivated plants in Brazil, Momordica charantia and Euphorbia heterophylla. Both viruses display the general genome structure of gemycircularviruses. The virus isolated from M. charantia showed the highest nucleotide sequence identity with Pteropus associated gemycircularvirus 5, and an atypical structure consisting of a hairpin embedded in the major stem-loop was observed in the intergenic region. The virus from E. heterophylla showed the highest nucleotide sequence identity with Odonata associated gemycircularvirus 1. Phylogenetic analysis groups the two new viruses together with other genomoviruses of the genus Gemycircularvirus.
Tubulavírus: evolução, taxonomia e interação com seu hospedeiro
(Universidade Federal de Viçosa, 2022-02-08) Rezende, Rafael Reis de; Alfenas-Zerbini, Poliane; http://lattes.cnpq.br/1345754571046369
Os tubulavírus são vírus filamentosos que infectam procariotos sem causar lise celular. O processo de infecção por esses vírus, em muitos casos, induz modificações no perfil fenotípico do hospedeiro. Alguns tubulavírus que infectam bactérias fitopatogênicas dos gêneros Ralstonia e Xanthomonas geram modificações do perfil fenotípicos, em alguns casos aumento em outros redução da patogenicidade dessas bactérias. A biologia e a aplicação biotecnológica dos tubulavírus têm sido amplamente exploradas, mas estudos sobre a interação com hospedeiros e evolução deste grupo de vírus são escassos. As bactérias do complexo de espécies Ralstonia solanacearum (CERS) são habitantes naturais do solo capazes de infectar e matar plantas. Estas bactérias migram do solo para o xilema através das raízes da planta, onde desenvolvem um denso biofilme que interrompe o fluxo do xilema, causando a morte das plantas. Ralstonia solanacearum inovirus Brazil 1 (RSIBR1) é um tubulavírus que infecta a bactéria Ralstonia solanacearum isolado UB2014, o qual é incapaz de causar morte em plantas de tomates. Para determinar se há relação entre a ausência de patogenicidade da R. solanacearum e a infecção pelo RSIBR1, o isolado Ralstonia pseudosolanacearum GMI1000 agressivo foi infectado com o RSIBR1. Após a infecção o isolado R. pseusosolanacearum perdeu a capacidade de causar em morte de plantas de tomate, porém foi capaz de colonizar as plantas ao longo do tempo. Portanto, este trabalho teve como objetivo ampliar o entendimento da interação tubulavírusRalstonia, bem como estudar a evolução dos tubulavírus e propor um sistema para sua classificação taxonômica. Observamos que a evolução dos tubulavírus é principalmente impulsionada pelos hospedeiros e que a reconstrução filogenética a partir de genomas completos dos tubulavírus pode ser uma ferramenta adequada para a classificação desse grupo de vírus, que permite associar sua história evolutiva com suas características biológicas. Estudo de formação de biofilme in vitro mostrou que a infecção pelo RSIBR1 induz um aumento na produção de biofilme pela bactéria Ralstonia pseudosolanacearum; modula a produção de biofilme em diferentes condições como a disponibilidade ou ausência de glicose e nutrientes; induz a perda da motilidade do tipo swimming, e reduz da motilidade do tipo twitching. Além disso, a infecção pelo RSIBR1 altera a estrutura do biofilme da bactéria R. pseudosolanacearum com estrutura semelhante a tapete para um biofilme com estruturas com estruturas esféricas. Além disso, a infecção por RSIBR1 leva a uma redução na produção das vesículas externas, afeta a quantidade de DNA e proteínas nestas vesículas. For fim, também detectamos que o RSIBR1 expressa dois RNAs pequenos. Em conjuntos, esses fatores podem estar envolvidos na conversão fenotípica das bactérias do CERS. Palavras-chave: Tubulavírus. Complexo de espécie Ralstonia solanacearum. Biofilme. Vesículas extracelulares. Pequenos RNAs regulatórios. Evolução dos tubulavírus. Taxonomia de tubulavírus.