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Mecanismo de ação e efeitos imunoestimulatórios de bovicina HC5, uma bacteriocina produzida por Streptococcus bovis HC5
(Universidade Federal de Viçosa, 2011-07-28) Paiva, Aline Dias; Paula, Sérgio Oliveira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767540P4; Pereira, Maria Cristina Baracat; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780021E6; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; http://lattes.cnpq.br/6496294850014934; Drummond, Regina Maria Nardi; http://lattes.cnpq.br/9907101433477319; Moreira, Maria Aparecida Scatamburlo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4797678J6
Bovicina HC5 é um lantibiótico do tipo A produzido por Streptococcus bovis HC5, uma bactéria gram-positiva anaeróbia, isolada do rúmen de bovinos. Bovicina HC5 é um peptídeo de 2449 Da, anfifílico e positivamente carregado, com amplo espectro de atividade e que contém um padrão de anéis de lantionina semelhante ao encontrado em nisina, a bacteriocina mais conhecida. Resultados prévios indicaram que bovicina HC5 promove a liberação de potássio intracelular e a depleção de ATP intracelular nas células sensíveis, sendo que essa atividade é aumentada em condições de pH ácido. Entretanto, a atividade antimicrobiana de bovicina HC5 persiste mesmo em valores de pH alcalinos, o que sugere que bovicina HC5 possa ter outro mecanismo de ação juntamente com a depleção de potássio e ATP. Ainda que bovicina HC5 tenha sido caracterizada como uma bacteriocina efetiva e de amplo espectro antimicrobiano, a segurança para sua aplicação in vivo permanece limitada em função de poucas informações relacionadas ao mecanismo de ação aos efeitos imunoestimulatórios de bovicina HC5. Além disso, embora algumas estirpes de S. bovis sejam genética e fisiologicamente distintas de isolados patogênicos envolvidos em infecções em humanos, os efeitos da administração de S. bovis HC5 a modelos animais ainda não foram estudados. Neste trabalho, o mecanismo de ação de bovicina HC5 foi elucidado, tendo como foco o papel do Lipídeo II, sendo também avaliados os efeitos morfológicos e imunoestimulatórios de bovicina HC5 e S. bovis HC5 após administração oral a camundongos BALB/c. Utilizando membranas modelo artificiais de diferentes composições lipídicas e ensaios de permeabilidade foi possível determinar que o xxviLipídeo II, um importante precursor da síntese da parede celular em bactérias, é utilizado como alvo específico de bovicina HC5 em células bacterianas sensíveis. A atividade de formação de poros de bovicina HC5 foi claramente dependente da espessura da membrana e pode ser detectada somente em membranas finas. Bovicina HC5 foi capaz de recrutar moléculas de Lipídeo II em estruturas semelhantes a poros, e de sequestrar moléculas de Lipídeo II em domínios, inibindo a síntese da parede celular bacteriana. Em seguida, a interação entre bovicina HC5 e Lipídeo II foi examinada utilizando espectroscopia de fluorescência do triptofano e dicroísmo circular. A presença de Lipídeo II alterou a orientação de bovicina HC5 em membranas lipídicas, de paralelo para perpendicular em relação à superfície da membrana, e a estrutura secundária de bovicina HC5 foi também significativamente alterada após interação com Lipídeo II. A interação de bovicina HC5 com Lipídeo II foi altamente estável, ocorrendo mesmo em pH 2,0. De acordo com esses resultados, bovicina HC5 possui mecanismo de ação semelhante ao da nisina, embora algumas diferenças em relação à capacidade de formação de poros e interação com Lipídeo II tenham sido demonstradas. Os efeitos da administração oral de bovicina HC5 e S. bovis HC5 (células viáveis e mortas após tratamento térmico) a sistemas modelos animais foram também avaliados. A administração oral de bovicina HC5 por 58 dias a camundongos BALB/c resultou em reduzido ganho de peso e alterações no intestino delgado, embora nenhuma mudança fisiológica tenha sido detectada no intestino. Um aumento da expressão relativa de TGF-β, INF-γ e IL-12 no intestino delgado foi observado após administração de bovicina HC5. Importantes alterações histológicas e morfométricas foram detectadas no intestino dos animais tratados com S. bovis HC5. A produção de citocinas no intestino também foi alterada após administração oral de S. bovis HC5, e o padrão de expressão de citocinas diferiu entre células vivas e mortas após tratamento térmico. Um aumento na expressão relativa de IL-12 e INF-γ foi observado em animais que receberam células viáveis de S. bovis HC5, enquanto um aumento na expressão relativa de IL-5, IL-13 e TNF-α foi detectado em animais tratados com células de S. bovis HC5 mortas após tratamento térmico. Esses resultados indicam que a administração oral de bovicina HC5 causou alterações morfológicas no intestino delgado de camundongos BALB/c, sendo capaz de estimular o sistema imune em nível local. A administração oral de S. bovis HC5 resultou em alterações histológicas e morfométricas no intestino, havendo diferenças distintas na atividade imunoestimulatória de células vivas e mortas de S. bovis HC5.
Produção de anticorpos policlonais para detecção de bovicina HC5 por ensaios imunoenzimáticos
(Universidade Federal de Viçosa, 2007-06-28) Paiva, Aline Dias; Paula, Sérgio Oliveira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767540P4; Pereira, Maria Cristina Baracat; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780021E6; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026Z7; http://lattes.cnpq.br/6496294850014934; Moraes, Célia Alencar de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781007D6; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3
Algumas bactérias produzem peptídeos antimicrobianos denominados bacteriocinas, que apresentam ação bactericida ou bacteriostática sobre bactérias da mesma espécie ou de espécies filogeneticamente relacionadas. Esses peptídeos têm sido estudados principalmente devido ao potencial para aplicação na indústria de alimentos, na medicina e na agropecuária. Bovicina HC5, uma bacteriocina produzida por Streptococcus bovis HC5, apresenta similaridade com os lantibióticos e possui amplo espectro de ação. Apesar do grande potencial de aplicação das bacteriocinas, a produção destes peptídeos é frequentemente limitada pelos métodos de detecção, quantificação e purificação utilizados. Entretanto, os ensaios imunoenzimáticos podem ser utilizados como uma alternativa mais eficiente para a detecção e purificação de peptídeos antimicrobianos. Este trabalho teve como objetivo produzir anticorpos policlonais para detectar e quantificar a bacteriocina bovicina HC5 por meio de ensaios imunoenzimáticos e determinar o efeito citotóxico da bacteriocina sobre células Vero. A produção de anticorpos policlonais foi realizada com o peptídeo purificado em HPLC seguido da imunização de coelhos New Zealand e camundongos BALB/c e coleta periódica de sangue por até 60 dias. A análise imunoenzimática foi realizada por ELISA indireta e Western blotting em amostras coletadas de soro sanguíneo, extrato de células de S. bovis HC5 ou sobrenadante das culturas cultivadas em meio basal. Bovicina HC5 foi capaz de gerar resposta imunológica, de intensidade moderada. Nenhuma reação inespecífica dos anticorpos foi observada com o sobrenadante de outras culturas lácticas nos ensaios de Western blotting e ELISA indireta, sendo detectada somente a bovicina HC5 purificada. No ensaio de difusão em meio sólido, o antissoro anti-bovicina HC5 neutralizou a atividade da bacteriocina em 75 %. Bioensaios indicaram que a bovicina HC5 começou a ser produzida durante o crescimento exponencial de S. bovis HC5 e a atividade biológica da bacteriocina aumentou quando a cultura atingiu a fase estacionária de crescimento. A bovicina HC5 foi detectada no extrato de células e no sobrenadante da cultura de S. bovis HC5 pela técnica de ELISA indireta, a qual apresentou correlação com a atividade determinada por meio de bioensaios. A bovicina HC5 apresentou efeito tóxico sobre células Vero em concentrações iguais ou superiores a 100 μg mL-1. Esses resultados indicam que ensaios imunoenzimáticos podem ser utilizados para a detecção de bovicina HC5, porém outros trabalhos deverão ser realizados para aumentar a sensibilidade da técnica. O efeito de bovicina HC5 sobre diferentes linhagens celulares deverá ser determinado para avaliar o potencial tóxico deste peptídeo e sua possível aplicação na produção animal.
Role of lipid II and membrane thickness in the mechanism of action of the lantibiotic bovicin HC5
(Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2011-08-19) Paiva, Aline Dias; Breukink, Eefjan; Mantovani, Hilário Cuquetto
Lantibiotics are antimicrobial peptides produced by Gram-positive bacteria, nisin being the most well known member. Nisin inhibits peptidoglycan synthesis and forms pores at sensitive membranes upon interaction with lipid II, the essential bacterial cell wall precursor. Bovicin HC5, a bacteriocin produced by Streptococcus bovis HC5, has the putative N-terminal lipid II binding motif, and we investigated the mode of action of bovicin HC5 using both living bacteria and model membranes, with special emphasis on the role of lipid II. Bovicin HC5 showed activity against Staphylococcus cohnii and Staphylococcus warneri, but bovicin HC5 hardly interfered with the membrane potential of S. cohnii. In model membranes, bovicin HC5 was not able to cause carboxyfluorescein release or proton influx from DOPC vesicles containing lipid II. Bovicin HC5 blocked lipid II-dependent pore formation activity of nisin, and a high-affinity interaction with lipid II was observed (apparent binding constant [K a ] ⴝ 3.1 ⴛ 10 6 M ⴚ1 ), with a 1:1 stoichiometry. In DOPC vesicles containing lipid II, bovicin HC5 was able to assemble with lipid II into a prepore-like structure. Furthermore, we observed pore formation activity of bovicin HC5, which was stimulated by the presence of lipid II, in thin membranes. Moreover, bovicin HC5 induced the segregation of lipid II into domains in giant model membrane vesicles. In conclusion, bovicin HC5 has a primary mode of action similar to that of nisin, but some differences regarding the pore-forming capacity were demonstrated.
Safety evaluation of the antimicrobial peptide bovicin HC5 orally administered to a murine model
(BMC Microbiology, 2013) Paiva, Aline Dias; Fernandes, Kenner Morais; Dias, Roberto Sousa; Rocha, Alípio dos Santos; Oliveira, Leandro Licursi de; Neves, Clóvis Andrade; Paula, Sérgio Oliveira de; Mantovani, Hilário Cuquetto
Bovicin HC5 is an antimicrobial peptide that shows a broad spectrum of activity and potential for biotechnological and therapeutic applications. To gain insight about the safety of bovicin HC5 application, the histological and immunostimulatory effects of orally administrated bovicin HC5 to BALB/c mice were evaluated. BALB/c mice were divided into three groups: negative control (NC group); mice given purified bovicin HC5 (Bov group); mice given ovalbumin (positive control, PC group; a murine model of enteropathy). The mice were initially pre-sensitized, and PBS, bovicin HC5 or ovalbumin were administered for 30 days by daily gavages. Histological and morphometric analysis were performed and the relative expression of cytokines was analyzed by real-time RT-PCR. The oral administration of bovicin HC5 to BALB/c mice reduced weight gain and caused alterations in the small intestine, although absorptive changes have not been detected. The number of total goblet cells and the mucopolysaccharides production were not affected by bovicin HC5 administration. A hypertrophy of Paneth cells and an increase in the number of mitotic cells were observed in Bov group, while the number of mast cells remained unaltered. Increased expression of TNF-α, INF-γ and IL-12 was observed in the small intestine upon bovicin HC5 administration. Bovicin HC5 has only minor effects on intestinal permeability and did not elicit an allergenic response upon oral administration to animal models. Considering the low in vivo toxicity of bovicin HC5, it might be a good candidate for enteral applications.
Toxicity of bovicin HC5 against mammalian cell lines and the role of cholesterol in bacteriocin activity
(Microbiology, 2012-09-03) Paiva, Aline Dias; Oliveira, Michelle Dias de; Paula, Sérgio Oliveira de; Baracat-Pereira, Maria Cristina; Breukink, Eefjan; Mantovani, Hilário Cuquetto
Bacteriocins are ribosomally synthesized antimicrobial peptides produced by Bacteria and some Archaea. The assessment of the toxic potential of antimicrobial peptides is important in order to apply these peptides on an industrial scale. The aim of the present study was to investigate the in vitro cytotoxic and haemolytic potential of bovicin HC5, as well as to determine whether cholesterol influences bacteriocin activity on model membranes. Nisin, for which the mechanism of action is well described, was used as a reference peptide in our assays. The viability of three distinct eukaryotic cell lines treated with bovicin HC5 or nisin was analysed by using the MTT assay and cellular morphological changes were determined by light microscopy. The haemolytic potential was evaluated by using the haemoglobin liberation assay and the role of cholesterol on bacteriocin activity was examined by using model membranes composed of DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) and DPoPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine). The IC50 of bovicin HC5 and nisin against Vero cells was 65.42 and 13.48 µM, respectively. When the MTT assay was performed with MCF-7 and HepG2 cells, the IC50 obtained for bovicin HC5 was 279.39 and 289.30 µM, respectively, while for nisin these values were 105.46 and 112.25 µM. The haemolytic activity of bovicin HC5 against eukaryotic cells was always lower than that determined for nisin. The presence of cholesterol did not influence the activity of either bacteriocin on DOPC model membranes, but nisin showed reduced carboxyfluorescein leakage in DPoPC membranes containing cholesterol. In conclusion, bovicin HC5 only exerted cytotoxic effects at concentrations that were greater than the concentration needed for its biological activity, and the presence of cholesterol did not affect its interaction with model membranes.