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Computer aided identification of a Hevein-like antimicrobial peptide of bell pepper leaves for biotechnological use
(BioMed Central Genomics, 2016-12-15) Games, Patrícia Dias; Silva, Elói Quintas Gonçalves da; Barbosa, Meire de Oliveira; Almeida-Souza, Hebréia Oliveira; Fontes, Patrícia Pereira; Magalhães-Jr, Marcos Jorge de; Pereira, Paulo Roberto Gomes; Prates, Maura Vianna; Franco, Gloria Regina; Faria-Campos, Alessandra; Campos, Sérgio Vale Aguiar; Baracat-Pereira, Maria Cristina
Antimicrobial peptides from plants present mechanisms of action that are different from those of conventional defense agents. They are under-explored but have a potential as commercial antimicrobials. Bell pepper leaves (‘Magali R’) are discarded after harvesting the fruit and are sources of bioactive peptides. This work reports the isolation by peptidomics tools, and the identification and partially characterization by computational tools of an antimicrobial peptide from bell pepper leaves, and evidences the usefulness of records and the in silico analysis for the study of plant peptides aiming biotechnological uses. Aqueous extracts from leaves were enriched in peptide by salt fractionation and ultrafiltration. An antimicrobial peptide was isolated by tandem chromatographic procedures. Mass spectrometry, automated peptide sequencing and bioinformatics tools were used alternately for identification and partial characterization of the Hevein-like peptide, named HEV-CANN. The computational tools that assisted to the identification of the peptide included BlastP, PSI-Blast, ClustalOmega, PeptideCutter, and ProtParam; conventional protein databases (DB) as Mascot, Protein-DB, GenBank-DB, RefSeq, Swiss-Prot, and UniProtKB; specific for peptides DB as Amper, APD2, CAMP, LAMPs, and PhytAMP; other tools included in ExPASy for Proteomics; The Bioactive Peptide Databases, and The Pepper Genome Database. The HEV-CANN sequence presented 40 amino acid residues, 4258.8 Da, theoretical pI-value of 8.78, and four disulfide bonds. It was stable, and it has inhibited the growth of phytopathogenic bacteria and a fungus. HEV-CANN presented a chitin-binding domain in their sequence. There was a high identity and a positive alignment of HEV-CANN sequence in various databases, but there was not a complete identity, suggesting that HEV-CANN may be produced by ribosomal synthesis, which is in accordance with its constitutive nature. Computational tools for proteomics and databases are not adjusted for short sequences, which hampered HEV-CANN identification. The adjustment of statistical tests in large databases for proteins is an alternative to promote the significant identification of peptides. The development of specific DB for plant antimicrobial peptides, with information about peptide sequences, functional genomic data, structural motifs and domains of molecules, functional domains, and peptide-biomolecule interactions are valuable and necessary
Detecção e isolamento de peptídeos antimicrobianos de folhas de Capsicum annum L. (pimentão Magali R )
(Universidade Federal de Viçosa, 2009-02-10) Games, Patrícia Dias; Romeiro, Reginaldo da Silva; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783791J6; Carvalho, Claudine Márcia; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4794965T6; Pereira, Maria Cristina Baracat; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780021E6; http://lattes.cnpq.br/0816769642196047; Leite, João Paulo Viana; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763897U8; Prates, Maura Vianna; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4795647J7
Peptídeos antimicrobianos (AMPs) têm atraído a atenção de pesquisadores como pontenciais compostos de defesa para serem usados no agronegócio. Eles apresentam mecanismos de ação diferentes dos compostos disponíveis comercialmente. O objetivo deste trabalho foi, por técnicas proteômicas, bioprospectar o potencial antimicrobiano de frações enriquecidas em peptídeos de folhas de pimentão (Capsicum annum Magali R ) contra fitopatógenos de importância comercial, objetivando aplicação biotecnológica. Folhas de pimentão foram maceradas com tampão Tris acrescido de inibidores de proteases, o homogenato foi centrifugado, e o sobrenadante foi nomeado extrato solúvel (ES). O precipitado foi ressuspendido em solução de LiCl contendo inibidores de proteases, o homogenato foi centrifugado e o sobrenadante foi denominado extrato de parede celular (EP). Com o objetivo inicial de confirmar a presença de AMPs, os extratos de pimentão foram fracionados com sal (Sulfato de Amônio) e por cromatografias de exclusão molecular (CEM) e hidrofóbica (CH). P2-ES1 e P2-EP1 obtidas após a CEM, deram origem respectivamente a nove (H1 a H9) e oito (H1 a H8) picos promissores à avaliação antimicrobiana quando separados por CH, observando-se que P2-EP1 corresponde a uma fração menos complexa enriquecida em peptídeos. As frações H3 e H4 de P2-EP1 apresentaram alta atividade inibitória para duas bactérias-teste avaliadas, Ralstonia solanacearum (Gram-negativa) e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Gram-positiva). Com o objetivo de simplificar o processo para futuras aplicações comerciais, procedimentos de ultrafiltração (1-10 kDa) substituíram os passos cromatográficos. Além das bactérias mencionadas acima, as frações recuperadas após ultrafiltração (ES1-10 e EP1-10) foram também capazes de inibir o crescimento da bactéria Erwinia carotovora subsp. carotovora e do fungo Alternaria solani. O crescimento das bactérias Pseudomonas syringae pv. tomato e Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, e dos fungos Fusarium solani, Alternaria brassicicola, Pyricularia grisea e Rhizoctonia solani não foi inibido pelo extratos peptídicos. O procedimento de ultrafiltração foi essencial para a recuperação de grande quantidade de amostra parcialmente fracionada enriquecida em peptídeos. A etapa de ultrafiltração corresponde a um procedimento fácil, rápido e de baixo custo. E especialmente permite a recuperação de amostras nativas para ensaios biológicos. Para estudos analíticos das amostras, ES1-10 e EP1-10 foram submetidos à cromatografia de fase reversa em HPLC usando resinas C18 e C4 para purificação dos extratos. Para ES1-10 foram encontrados 13 picos promissores, e para EP1-10, 2 picos após C18-RPHPLC. Foi verificada a presença de bandas peptídicas após RP-C18- HPLC, principalmente no pico 3 de ES1-10, quando este foi ressubmetido à RP-C4-HPLC, originando o pico 3.1, que foi então submetido ao sequenciamento de aminoácidos. Por espectrometria de massa (MALDI/TOF-TOF), foram encontradas massas moleculares inferiores a 10 kDa para diversos picos provenientes da C18-RP-HPLC, e as seqüências aminoacídicas encontradas até então não apresentaram similaridade a peptídeos antimicrobianos relatados na literatura. Estes extratos antimicrobianos podem ser biotecnologicamente explorados para aplicação comercial como compostos de defesa.
Enzimas marcadoras de indução de resistência diferencialmente reguladas em soja resistente e suscetível à ferrugem-asiática-da-soja
(Pesquisa Agropecuária Brasileira, 2012-01-09) Almeida, Hebréia Oliveira; Barbosa, Meire de Oliveira; Marques, Ana Ermelinda; Pereira, Tânus Henrique Abdalla; Magalhães Júnior, Marcos Jorge; Tessarollo, Nayara Gusmão; Games, Patrícia Dias; Barros, Everaldo Gonçalves de; Stolf-Moreira, Renata; Marcelino-Guimarães, Francismar Corrêa; Abdelnoor, Ricardo Vilela; Pereira, Paulo Roberto Gomes; Baracat-Pereira, Maria Cristina
O objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de enzimas marcadoras, a indução de resistência à ferrugem-asiática-da-soja em genótipos de soja contrastantes quanto à suscetibilidade a Phakopsora pachyrhizi. Aproteína total e as atividades de cinco enzimas marcadoras da indução de resistência (lipoxigenases, peroxidases, fenilalanina amônia-liase, quitinases e β-1, 3-glucanases) foram avaliadas em extratos de folhas de plantas de soja dos genótipos Embrapa 48 (suscetível) e PI 561356 (resistente), submetidas à inoculação ou não com o patógeno. Foram observadas respostas de defesa discrepantes entre os dois genótipos e entre os tempos de coleta (12, 72 e 168 horas após inoculação). A resposta de indução dessas enzimas assemelha-se à defesa bifásica, para Embrapa 48, e é consistente com o observado para outros patossistemas. No entanto, o genótipo PI 561356 respondeu com diminuição da concentração de proteína total e das atividades enzimáticas, o que indica redução do metabolismo geral das plantas infectadas. Há um importante mecanismo de resistência do genótipo PI 561356, ainda não relatado, embasado em vias que envolvem essas enzimas marcadoras e em mecanismos que utilizam menor concentração de proteínas, como os de via metabólica de resposta em cascata.
Insights into the proteome of the spermatheca of the leaf- cutting ant Atta sexdens rubropilosa (Hymenoptera: Formicidae)
(Florida Entomologist, 2014-12) Malta, Juliana; Martins, Gustavo Ferreira; Marques, Ana Ermelinda; Games, Patrícia Dias; Zanuncio, José Cola; Baracat- Pereira, Maria Cristina; Salomão, Tânia Maria Fernandes
Fifteen of the 22 differentially expressed proteins in the spermathecae of virgin and inseminated females of the leaf cutting ant Atta sexdens rubropilosa were tentatively identified. The profile of expressed proteins of the spermatheca differed significantly between virgin and fertilized females. Data from this study should contribute to the elucidation of the roles of these various proteins in prolonged storage and maintenance of viable spermatozoa within the female.
Plantas de pimentão submetidas à injúria mecânica modificam a expressão de proteínas em plantas vizinhas não injuriadas
(Revista Brasileira de Agropecuária Sustentável, 2013-07-25) Games, Patrícia Dias; Fontes, Patrícia Pereira; Carrijo, Lanna Clicia; Magalhães Júnior, Marcos Jorge; Pereira, Paulo Roberto Gomes; Baracat-Pereira, Maria Cristina
A proteômica avalia eventos biológicos por análise das proteínas expressas em células ou tecidos em situações fisiológicas diferentes. Na proteômica de plantas, visando manter padrões de cultivo, plantas tratadas e não tratadas são muitas vezes cultivadas no mesmo ambiente, sem considerar alterações por plantas tratadas sobre a expressão de proteínas de plantas não tratadas. O objetivo desse trabalho foi, por proteômica, avaliar a expressão diferencial de proteínas em folhas de plantas de pimentão (Capsicum annuum L. ́Magali R‘) não-feridas (não-tratadas) e feridas (tratadas) por injúria mecânica, quando cultivadas ou não próximas fisicamente. Aos 40 dias após o plantio, parte das plantas foi submetida à injúria por ferimentos nas folhas totalmente expandidas (feridas, F), e parte foi reservada como plantas não-feridas, ou cultivadas perto das plantas F (NFP, a 0,15 m) ou cultivadas longe das plantas F (NFL, a 10 m). As folhas das plantas NFP e NFL foram coletadas às 12, 48 e 168 h após ferimentos das plantas F, e os extratos NFL e NFP foram analisados por eletroforese bidimensional (2-DE). Os perfis proteicos foram comparados por Image Master, e as proteínas identificadas usando espectrometria de massas. Houve menor concentração de proteína em extratos de NFP 12 h; em 48 h e 168 h, a proteína foi semelhante entre NFL e NFP. Por 2-DE, não houve diferenças significativas entre NFP e NFL 12 h, porém para NFP 48 h foi observada maior expressão de proteínas envolvidas na defesa de plantas. Para NFP 168 h, houve aumento da expressão de proteínas envolvidas no metabolismo normal. Esses resultados indicam ter havido respostas de defesa das plantas NFP, decorrentes da proximidade do cultivo dessas plantas com as plantas F, possivelmente por ação de voláteis. Coloca-se assim a importância da escolha das condições de cultivo dos tratamentos-controle, não apenas para análises proteômicas.
Separomics applied to the proteomics and peptidomics of low-abundance proteins: choice of methods and challenges - a review
(Genetics and Molecular Biology, 2011-01-24) Baracat-Pereira, Maria Cristina; Barbosa, Meire de Oliveira; Magalhães Júnior, Marcos Jorge; Carrijo, Lanna Clicia; Games, Patrícia Dias; Almeida, Hebréia Oliveira; Sena Netto, José Fabiano; Pereira, Matheus Rodrigues; Barros, Everaldo Gonçalves de
The enrichment and isolation of proteins are considered limiting steps in proteomic studies. Identification of proteins whose expression is transient, those that are of low-abundance, and of natural peptides not described in databases, is still a great challenge. Plant extracts are in general complex, and contaminants interfere with the identification of proteins involved in important physiological processes, such as plant defense against pathogens. This review discusses the challenges and strategies of separomics applied to the identification of low-abundance proteins and peptides in plants, especially in plants challenged by pathogens. Separomics is described as a group of methodological strategies for the separation of protein molecules for proteomics. Several tools have been used to remove highly abundant proteins from samples and also non-protein contaminants. The use of chromatographic techniques, the partition of the proteome into subproteomes, and an effort to isolate proteins in their native form have allowed the isolation and identification of rare proteins involved in different processes.