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Caracterização molecular de um vírus com genoma de DNA que infecta Ralstonia solanacearum e caracterização de proteínas H-NS e sua função na regulação do sistema CRISPR-CAS
(Universidade Federal de Viçosa, 2017-02-24) Almeida, Juliana Cristina Fraleon de; Zerbini, Poliane Alfenas; http://lattes.cnpq.br/7086745067874322
Os vírus que infectam bactérias são os organismos mais abundantes do planeta, e desempenham importantes funções para a manutenção do ecossistema. Nos últimos anos, o uso de vírus como ferramenta de controle biológico tem ganhado bastante atenção, devido, principalmente, à dificuldade de se isolar novas drogas antimicrobianas e à seleção de bactérias resistentes às drogas já existentes. Devido a esse potencial como agentes de controle biológico, as descobertas sobre esses vírus tem aumentado o que amplia as perspectivas do manejo ecológico de doenças em plantas. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos i) caracterizar um bacteriófago isolado de Ralstonia solanacearum proveniente do estado do Ceará, Brasil ii) caracterizar proteínas H-NS de Ralstonia solanacearum e estudar seu o efeito regulatório no sistema CRISPR-Cas. A partir de um isolado não patogênico de Ralstonia solanacearum, foi isolado um vírus filamentoso que possui um ciclo de multiplicação do tipo pseudo-lisogênico. O genoma viral foi completamente sequenciado, possui 6945 nucleotídeos e conteúdo de GC de 61,25%. A organização genômica é típica de vírus da família Inoviridae, gênero Inovirus. Comparação da sequência obtida com sequências de outros Inovirus sugere que o isolado viral é uma nova espécie do grupo φRSM, tentativamente denominada Ralstonia solanacearum Inovirus Brazil 1 (RSIBR1). Partículas de RSIBR1 foram transmitidas para R. pseudosolanacearum, que quando infectadas pelo RSIBR1 também perdeu a capacidade de causar doença em plantas de tomate, sugerindo que a infecção viral interfere com a patogenicidade de Ralstonia spp. Em estudos anteriores, foi demonstrado que o sistema CRISPR-Cas de Ralstonia solanacearum é inativo. Para avaliar se essa inatividade pode ser explicada pela presença de proteínas do tipo H-NS,foi realizada uma busca por genes que codificam H-NS no genoma de Ralstonia solanacearum. Três cópias de H-NS (H-NS 1, 2 e 3) foram localizadas no megaplasmídeo. Não foram identificadas cópias de H-NS codificadas no cromossomo bacteriano. As H-NS de Ralstonia solanacearum possuem os domínios de oligomerização e de ligação a DNA bem conservados. A análise filogenética de proteínas H-NS de diferentes bactérias agruparam de acordo com as famílias Enterobacteriaceae,Pseudomonadaceae e Ralstoniaceae. Além disso, foi observado que as proteínas H-NS da família Ralstoniaceae são altamente conservadas com H-NS codificadas por podovírus, sugerindo que as H-NS de Ralstoniaceae podem ser de origem viral. Foi realizada uma análise in silico nos promotores das proteínas CAS para verificar a presença de sítios de ligação de H-NS. Foram identificadas regiões de alto conteúdo AT, com curvatura típica potencial para a ligação de H-NS. A análise da expressão das H-NS mostrou que somente as H-NS 1 e 3 são expressas em Ralstonia solanacearum. Para confirmar que as proteínas H-NS possuem efeito regulatório na expressão dos genes Cas, foram construídos cassetes para a obtenção de mutantes para H-NS1, H-NS 2 e H-NS3. A obtenção dos mutantes e a análise da expressão dos genes Cas nos mutantes irão permitir elucidar o papel regulatório de H-NS na expressão do sistema CRISPR-Cas em Ralstonia solanacearum.
Characterization of CRISPR-Cas systems in the Ralstonia solanacearum species complex
(Molecular Plant Pathology, 2019-02) Xavier, André da Silva; Almeida, Juliana Cristina Fraleon de; Melo, Alessandra Gonçalves de; Rousseau, Geneviève M.; Tremblay, Denise M.; Rezende, Rafael Reis de; Moineau, Sylvain; Alfenas‐Zerbini, Poliane
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) are composed of an array of short DNA repeat sequences separated by unique spacer sequences that are flanked by associated (Cas) genes. CRISPR-Cas systems are found in the genomes of several microbes and can act as an adaptive immune mechanism against invading foreign nucleic acids, such as phage genomes. Here, we studied the CRISPRCas systems in plant-pathogenic bacteria of the Ralstonia sola- nacearum species complex (RSSC). A CRISPR-Cas system was found in 31% of RSSC genomes present in public databases. Specifically, CRISPR-Cas types I-E and II-C were found, with I-E being the most common. The presence of the same CRISPRCas types in distinct Ralstonia phylotypes and species suggests the acquisition of the system by a common ancestor before Ralstonia species segregation. In addition, a Cas1 phylogeny (I-E type) showed a perfect geographical segregation of phylotypes, supporting an ancient acquisition. Ralstonia solanacearum strains CFBP2957 and K60 T were challenged with a virulent phage, and the CRISPR arrays of bacteriophage insensitive mutants (BIMs) were analysed. No new spacer acquisition was detected in the analysed BIMs. The functionality of the CRISPR-Cas interference step was also tested in R. solanacearum CFBP2957 using a spacer-protospacer adjacent motif (PAM) delivery system, and no resistance was observed against phage phiAP1. Our results show that the CRISPR-Cas system in R. solanacearum CFBP2957 is not its primary antiviral strategy.
Inclusão de alunos surdos em uma escola pública mineira: uma visão de pais, alunos e profissionais
(Revista de Ciências Humanas, 2013-06-10) Almeida, Juliana Cristina Fraleon de; Costa, Patrícia Claudia da
O objetivo deste trabalho é analisar, por meio de uma bordagem qualitativa, a inclusão de crianças com deficiência auditiva numa escola pública,para compreender os aspectos positivos e negativos desse tipo de inclusão. Os dados foram coletados com questionários específicos para estudantes surdos, seus pais e professores. Também se observou o convívio escolar no recreio, nas aulas diárias, na resolução de provas e de exercícios em sala de aula. A análise aponta que a inclusão ainda não está acontecendo de fato e que diversos fatores dificultam o aprendizado e a interação com os professores e colegas de classe, apesar de a socialização se mostrar positiva em alguns aspectos.