Envolvimento de chaperonas moleculares na infecção do potyvírus Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) em hospedeiros suscetíveis

Abstract

Os vírus que infectam plantas apresentam um genoma pequeno e codificam um número reduzido de proteínas. A limitação do número de proteínas virais é superada pela modulação da expressão de genes na célula hospedeira. O mapeamento das redes de interações entre fatores do patógeno e do hospedeiro tem fornecido respostas importantes para a compreensão dos processos que favorecem a infecção viral. O objetivo deste trabalho foi avaliar a contribuição de duas proteínas do tomateiro, a chaperona citosólica Hsp70 e sua co-chaperona DnaJ (classe 1) no estabelecimento da infecção pelo Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). Essas duas proteínas foram identificadas com a expressão induzida em células infectadas pelo PepYMV. A sequencia codificadora da Hsp70 de tomateiro (SlHsp70) foi clonada e sequenciada. A análise in silico mostrou a presença de todos os domínios típicos de uma Hsp70. Alinhamento entre a sequencia da proteína SlHsp70, e as Hsps70 de Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana e Nicotiana tabacum mostrou uma alta conservação na sequência de aminoácidos das quatro proteínas alinhadas. A localização subcelular de SlHsp70 em células infectadas pelo PepYMV foi analisada por microscopia confocal. Células sadias e infectadas apresentaram uma localização nuclear e citoplasmática, entretanto em células infectadas foi possível observar a expressão da Hsp70 em estruturas ancoradas a membrana semelhantes a vesículas replicativas induzidas pela proteína viral 6K2. Para avaliar a ocorrência de interação entre SlHsp70 com proteínas virais, e SlDj1 com proteínas virais foi realizado um ensaio de duplo hibrido em leveduras. Não houve a detecção de nenhuma interação entre as proteínas do PepYMV e as proteínas SlHsp70 e SlDj1. Foi detectado a ocorrência de interação entre SlHsp70 e SlDj1. Com o objetivo de avaliar o efeito do silenciamento de SlDj1 na infecção viral, plantas de tomateiro foram transformadas com uma construção que induz o silenciamento de SlDj1 via Agrobacterium tumefaciens. As plantas transformadas silenciadas apresentaram um fenótipo de letalidade e esse fenômeno não permitiu a quantificação do acúmulo do PepYMV em tomateiros transformados. Os resultados deste trabalho sugerem que as proteínas SlHsp70 e SlDj1 favorecem a infecção viral de forma indireta, e que estudos mais detalhados irão formecer informações sobre o envolvimento dessas proteínas no processo de infecção pelo PepYMV.

Viruses are obligate intracellular parasites with a small genome and encode a limited number of proteins. Limitation in the number of viral proteins is overcome by modulating the expression of certain genes in the host cell. Mapping interaction networks between pathogen and host factors has provided important answers to the understanding of the processes that promote viral infection. This study objective is to evaluate the contribution of the tomato proteins chaperone Hsp70 and its co- chaperone DnaJ in infection process with Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). These two proteins were investigated due to the modification of gene expression reports of transcripts in infected cells PepYMV. Initially the coding sequence corresponding to the tomato Hsp70 (SlHsp70) was analyzed in silico, the presence of all the domains of a typical Hsp70 was confirmed. Sequence alignment between the protein SlHsp70, and Hsps70 Arabidopsis thaliana, as well as Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum revealed high conservation in the amino acid sequence alignment of the four proteins. The subcellular localization by confocal scanning microscopy was performed with SlHsp70 and demonstrated a common cytoplasmic and nuclear localization to healthy cells and cells infected by PepYMV. The infected cells showed similar expression of Hsp70 in membrane-anchored structures, similar to replicative vesicles induced by 6K2. Study of protein-protein interaction was performed by two-hybrid assay in yeasts. Due to SlHsp70 chaperone and co-chaperone SlDj1 act together, the interactions between the PepYMV proteins were tested with both the vegetable proteins. There was no detection of any interaction between PepYMV proteins and vegetable proteins, a single interaction was detected between SlHsp70 and SlDj1. Genetic transformation of tomato plants by Agrobacterium tumefaciens was carried out to induce silencing of the gene encoding the protein SlDj1. The silenced plants showed a lethality phenotype, and this phenomenon did not allow the quantification of the PepYMV accumulation in processed tomato. These results suggest that SlHsp70 and SlDj1 proteins promove the viral infection indirectly, and that investigations in the PepYMV replication process can reveal interesting facts about the involvement of these proteins in infection.