Avaliação causal do "efeito proteína" sobre a atividade microbiana em substratos fibrosos insolúveis

Abstract

Objetivou-se avaliar os efeitos da suplementação com diferentes fontes de compostos nitrogenados sobre a utilização da fibra insolúvel por intermédio da mensuração do crescimento de bactérias ácido-láticas (BAL), produção microbiana e atividade das enzimas carboxi-metil-celulase (CMC) e glutamato desidrogenase (GDH). Foram realizados três experimentos. No primeiro experimento realizaram-se quatro incubações utilizando-se como inóculo o fluido ruminal de um novilho mestiço Holandês-Zebu fistulado no rúmen, e alimentado com pasto de capim-braquiária (Brachiaria decumbens Stapf.) e 200 g/dia de proteína bruta (PB) suplementar. O fluido ruminal coletado foi centrifugado e o pellet de microrganismos re-suspenso em meio basal utilizado como inoculo. Os substratos foram acondicionados em frascos de vidro de forma a compor oito tratamentos: Celulose, Celulose + Caseína, Celulose + Peptona de Soja, Celulose + Uréia:Sulfato de Amônio (9:1), Amido, Amido + Caseína, Amido + Peptona de Soja, Amido + Uréia:Sulfato de Amônio (9:1). Os frascos foram mantidos a 39 ºC, sob agitação orbital (70 rpm). Foram realizadas incubações sucessivas a fim de selecionar os microrganismos em função das fontes energéticas e de compostos nitrogenados. Após 24 horas de incubação, nas terceira e quarta transferências, procedeu-se à avaliação do pH e o fluido resultante foi diluído e plaqueado em meio seletivo para bactérias ácido láticas (BAL) segundo técnica de spread plate. Após 48 horas de crescimento, realizou-se a contagem das unidades formadoras de colônia por mL (UFC/mL). Com o objetivo de detectar a presença de substâncias inibidoras do crescimento microbiano, realizou-se teste de atividade inibitória com as BAL obtidas no procedimento anterior. O crescimento de BAL foi favorecido (P<0,05) quando se utilizou amido como fonte de energia em relação à celulose. As fontes de compostos nitrogenados de origem protéica (peptona de soja e caseína) estimularam o crescimento dessas bactérias (P<0,05) em comparação ao controle e ao uso de uréia.O pH não sofreu influência da fonte de energia (P>0,05); entretanto, a inclusão de uréia resultouem pH mais elevado (P<0,05) em relação às demais fontes de compostos nitrogenados Não foi detectada atividade antimicrobiana nas culturas de BAL isoladas. No segundo experimento realizaram-se três incubações segundo os mesmos procedimentos do experimento descrito anteriormente, avaliando-se quatro tratamentos: Celulose, Celulose + Caseína, Celulose + Uréia:Sulfato de Amônio (9:1) e Celulose + Casaminoácidos. Após uma transferência, tomou-se uma frasco de cada tratamento às 6, 12 e 24 horas de incubação, realizando-se extrações das enzimas e teste de atividades da CMC e da GHD. Incubou-se uma segunda bateria de frascos a fim de se obter amostras nos tempos 6, 12 e 24 horas para quantificação da concentração de nitrogênio amoniacal (NA) e de proteína microbiana. Nos três tempos de incubação, a concentração de NA foi maior (P<0,05) quando uréia foi utilizada como fonte de compostos nitrogenados. Às 12 e 24 horas de incubação as fontes de compostos nitrogenados protéicos (caseína e casaminoácidos) causaram incremento nas concentrações NA em relação ao controle (P<0,05). De maneira geral, a concentração de proteína microbiana manteve-se estável entre os tratamentos. A atividade da enzima CMC foi superior com a utilização de uréia e casaminoácidos (P<0,05) em relação ao controle e caseína. A suplementação com casaminoácidos propiciou maior atividade da GDH (P<0,05) em relação ao controle na 6ª hora de incubação. com posições intermediárias observadas para caseína e uréia, às 12 horas a atividade da GDH passou a serestimulada também pela caseína (P<0,05). Às 24 horas a atividade da GDH não apresentou diferenças entre tratamentos (P>0,05).Para o terceiro experimento utilizaram-se três novilhos mestiços Holandês x Zebu, compeso corporal inicial de 350 kg fistulados no rúmen, mantidos em baias individuais recebendo feno de Tifton (Cynodon sp.) ad libtum.Os tratamentos foram: controle, sem suplementação; suplementação com compostos nitrogenados não-protéicos (uréia:sulfato de amônio, 9:1); e suplementação com compostos nitrogenados protéicos (albumina). Para os tratamentos que compreenderam suplementação com compostos nitrogenados definiu-se o fornecimento em 1 g/kg de peso vivo dos animais em proteína bruta. O experimento foi conduzido segundo delineamento em quadrado latino 3 x 3, com três períodos experimentais com duração de cinco dias cada, sendo os três primeiros dias destinados à adaptação ruminal dos animais à suplementação. Para avaliação do pH e da concentração de NA ruminal coletou-se, no quarto dia de cada período experimental, alíquotas de líquido ruminal nos tempos 6, 12 e 24 horas após a suplementação. Simultaneamente a esta avaliação, conduziu-se procedimento de incubação in situ para quantificação da atividade das enzimas CMC e GHD. A média do pH do líquido de rúmen foi de 6,55, não havendo diferenças entre os tratamento e os tempos de avaliação (P>0,05). Em termos gerais, a atividade da GHD foi ampliada nos intervalos avaliados (P<0,05). Entretanto não foram observadas diferenças entre os tratamentos (P>0,05) sobre a atividade da GDH. De maneira geral, o tratamento controle apresentou maior atividade da CMC em relação ao tratamentos que continham fontes suplementares de nitrogênio (P<0,05). Entretanto, a suplementação com uréia propiciou maiores atividades da CMC em relação à albumina (P<0,05). As fontes de compostos nitrogenados (uréia e albumina) causaram incremento nas concentrações NA em relação ao controle (P<0,10). As concentrações de NA decresceram a partir do primeiro momento de avaliação (P<0,10). A partir dos resultados obtidos concluiu-se que fontes de compostos nitrogenados de origem protéica provocam efeitos deletérios sobre a utilização de substratos fibrosos insolúveis devido ao favorecimento do crescimento de bactérias fermentadoras de carboidratos não-estruturais.

The objective in this trial was to evaluate the effects of supplementation with nitrogenous compounds sources on insoluble fiber utilization of through acid lactic bacteria (LAB) growth, microbial protein production, and activity of the enzymes carboxymethilcellulase (CMC) and glutamate dehydrogenase (GDH). Three experiments were carried out. At the first one, four incubations were performed using the ruminal fluid taken from a Holstein x Zebu steer fitted with ruminal canullae and fed signal grass (Brachiaria decumbens Stapf.) pasture plus 200 g/day of supplemental protein. The fluid was collected and centrifuged. The microbial pellet was re-suspended in a basal media and used as inoculum. Eight treatments were evaluated: Cellulose, Cellulose plus Casein, Cellulose plus Soy Peptone, Cellulose plus Urea:Ammonium Sulfate (9:1), Starch, Starch plus Casein, Starch plus Soy Peptone, and Starch plus Urea:Ammonium Sulfate (9:1). The flasks were kept at 39°C with orbital shaking (70 rpm). Successive incubations were done to select the microorganisms according to the energy and nitrogenous sources. After 24 hours of incubation, on the third and fourth transfers, the pH were evaluated and the resulting fluid was diluted and plated on a selective media for LAB according to spread plate technique. After 48 hours the colonies forming units (CFU/mL) were counted. It wasperformed a test to detect the presence of inhibitory substances on the inhibitory activity by using the LAB obtained in the previous procedure. The growth of LAB was favored (P<0.05) when starch was used as energy source compared to cellulose. The true protein sources (soy peptone and casein) increased the growth of these bacteria (P<0.05) compared to control and urea. The pH was not affected by energy source (P>0.05), but the inclusion of urea resulted in higher pH (P<0.05) compared to other sources of nitrogenous compounds. None inhibitory activity was detect on LAB cultures. In the second experiment, three incubations were performed according to the experimental procedures described above. Four treatments were evaluated: Cellulose, Cellulose plus Casein, Cellulose plus Urea:Ammonium Sulfate (9:1), and Cellulose plus Casaminoacids. After the first transfer, a flask of each treatment was taken at 6, 12 and 24 hours of incubation. The microbial enzymes were extracted and the activities of CMC and GHD were evaluated. A second group of flasks was incubated in order to obtain samples at 6, 12 and 24 hours to quantify the concentration of ammonia nitrogen (AN) and microbial protein. In all incubation times higher AN concentration was observes for urea (P<0.05). At 12 and 24 hours of incubation the sources of true protein (casein and casaminoacids) caused increase in AN concentrations compared to control (P<0.05). In a general, the concentration of microbial protein was stable among treatments. The activity of CMC was higher with the use of urea and casaminoacids (P<0.05) compared to control and casein. Supplementation with casaminoacids implied higher activity of GDH (P<0.05) compared to control at 6 hours of incubation, with intermediate positions for casein and urea. At 12 hours, the activity of GDH was also stimulated by casein (P<0.05). At 24 hours the activity of GDH was not different among treatments (P>0.05). In the third experiment three Holstein x Zebu steers, with average initial body weight of 350 kg, fitted with ruminal canullae and kept in individual stalls, were used. The animals were fed Tifton hay (Cynodon sp.), ad libitum. The treatments were: control, without supplementation; supplementation with non-protein nitrogenous compounds (urea: ammonium sulfate, 9:1); and supplementation with true protein (albumin). The level of supplementation with nitrogenous compounds was 1 g/kg body weight in crude protein. The experiment was carried out according to a 3 x 3 Latin square design, with three experimental periods lasting five days each, being three days for the adaptation of animals to supplementation. In the fourth day of each experimental period, samples of rumen fluid were collected at 6, 12 and 24 hours after supplementation to evaluate pH and ruminal AN concentration. At same time, it was carried out an in situ incubation procedure in order to quantify the activity of the enzymes CMC and GHD. The average of the ruminal pH was 6.55, with no differences among treatments and time of evaluation (P>0.05). In a general way, the activity of GHD was increased between times of evaluation (P<0.05). However, there were no differences among treatments (P>0.05). The control treatment show higher activity of the CMC compared to treatments with supplementation (P<0.05). However, supplementation with urea implied higher activities of the CMC than albumin (P<0.05). The sources of nitrogen compounds (urea and albumin) caused increase in RAN concentrations compared to control (P<0.10). The concentrations of RAN decreased from the first moment of evaluation (P<0.10). From those results, it can be concluded that true protein sources cause deleterious effects on utilization of insoluble fibrous substrates because they stimulate the growth of nonstructural carbohydrates degrading bacteria.