Influência da ingestão de Bifidobacterium breve carreada no leite humano na modulação da microbiota intestinal, na histomorfometria do cólon, na produção de citocinas e de espécies reativas do oxigênio e do nitrogênio em modelo murino

Abstract

O objetivo desse trabalho foi avaliar grupos microbianos presentes no leite materno obtido de doadoras voluntárias durante o período de lactação de 10 a 30 dias e sua importância em bancos de leite humano. Verificar também o pH e o processo de modulação dos diferentes grupos microbianos presentes no conteúdo cecal em modelo murino, por meio da ingestão de leite materno pasteurizado adicionado ou não de Bifidobacterium breve. Analisar histomorfometricamente a região do cólon ascendente por meio da determinação da profundidade das criptas intestinais e verificar a resposta imunológica nos animais por meio da ingestão de leite materno pasteurizado adicionado ou não de Bifidobacterium breve no exsudato peritonial e células esplênicas para quantificação de citocinas, compostos intermediários do nitrogênio e do oxigênio. A experimentação foi dividida em quatro fases: Na primeira fase, procedeu-se ao cadastramento das doadoras no hospital e coleta do leite materno em domicílio; determinação da qualidade higiênico-sanitária por meio da quantificação de coliformes totais, mesófilos aeróbios totais e Staphylococcus aureus e determinação de pH em amostras de leite materno cru e pasteurizado. Na segunda fase foram selecionadas sete estirpes de bactérias bífidas (UFVCC 1083, 1091, 1099, 1103, 1105, 1108 e 1111) para comporem o pool probiótico que foi adicionado ao leite pasteurizado administrado diariamente aos animais. Na terceira fase do experimento empregou-se em cada repetição 48 fêmeas da raça Wistar com 21 a 23 dias de vida, recém-desmamadas que foram divididas em quatro grupos experimentais: Basal; Controle (dieta); LP (leite humano pasteurizado) e LPB (leite humano pasteurizado adicionado de bactérias bífidas). Os quatro animais que compuseram o grupo basal foram sacrificados no primeiro dia da experimentação (T0) e aqueles dos outros grupos foram alimentados diariamente (0,1 mL) via oral com auxílio de micropipeta esterilizada com diferentes dietas, durante 21 dias e posteriormente sacrificados. Determinou o pH e verificou-se a modulação de grupos microbianos presentes na região cecal por meio da determinação de contagens de bactérias bífidas, clostrídeos, Lactobacillus spp, coliformes totais e mesófilos aeróbios totais juntamente com a análise histomorfométrica da região do cólon ascendente desses animais por meio da determinação da profundidade das criptas intestinais; e na quarta fase do experimento foram utilizados 36 animais fêmeas da raça Wistar os quais foram alimentados diariamente (0,1 mL) via oral com auxílio de micropipeta esterilizada com diferentes tratamentos, que foram Controle (dieta); LP (leite humano pasteurizado) e LPB (leite humano pasteurizado adicionado de bactérias bífidas), durante 30 dias. Posteriormente foram sacrificados para determinação da resposta imunológica por meio da determinação das citocinas IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-α; da citotoxicidade celular, para determinação de compostos intermediários do nitrogênio (NO), e do oxigênio (H2O2), no sobrenadante de células do exsudato peritonial e esplênico. Conclui-se neste trabalho que apesar da eficiência do processo de pasteurização para patógenos verificado neste estudo, torna-se urgente a necessidade de conscientização por parte das doadoras no que se refere aos métodos de obtenção de coleta do leite materno. É preciso adoção de medidas mais rigorosas de monitoramento do controle de qualidade higiênico-sanitário na ordenha do leite humano coletado em domicílio, pois são imprescindíveis para garantir um alimento seguro para os recém-nascidos. Verificou-se nesta experimentação na região do cólon ascendente dos animais um aumento médio do comprimento das criptas com a idade e que esse aumento foi mais pronunciado no grupo de animais que recebeu Leite Pasteurizado (LP) e, também os resultados mostraram que a adição de bactérias bífidas ao leite materno (LPB) não apresentou risco de alteração da histomorfometria do cólon ascendente quanto ao parâmetro avaliado. Esta informação fundamenta que a adição de bactérias bífidas ao leite pasteurizado nos bancos de leite humano não interfere na integridade do epitélio e tem potencial de beneficiar as crianças que precisam fazer uso desta alternativa. Conclui-se também que bactérias bífidas adicionadas ao leite pasteurizado (LPB) exerceram efeito antagonista para coliformes totais na modulação da microbiota do conteúdo cecal, quando comparado com os outros tratamentos (LP e controle). Verificou-se também que as bactérias bífidas não apresentaram toxicidade oral com relação a viabilidade dos macrófagos e não promoveram efeito adverso na saúde dos animais testados. Finalmente, a administração de bactérias bífidas na dieta influenciou o sistema imunológico dos animais por meio da liberação dos mediadores apresentados. O acúmulo de informações sobre os efeitos benéficos dessas bactérias probióticas tem justificado sua adição em diversos produtos, incluindo o leite pasteurizado, sob a forma concentrada congelada nos bancos de leite humano, gerando alternativas na área de saúde pública no Brasil. E as evidências acumuladas sobre os benefícios decorrentes do uso das bactérias bífidas probióticas justificam o aprofundamento dos estudos sobre seu modo de ação, a fim de otimizar sua utilização como profiláticos e imunomoduladores.

The objectives of this work were to evaluate the microbial groups present in the human milk obtained from voluntary donors during a 10- to-30 day-lactating period and their importance in human milk banks, as well as to verify the pH and process of modulation of the different microbial groups present in the cecal content in the murine model, by means of ingesting pasteurized human milk, added Bifidobacterium breve or not; to analyze histomorpho metrically the ascending colon region by determining the intestinal crypt depth and verify the animals immunological response by means of ingesting pasteurized human milk added Bifidobacterium breve or not, in the peritoneal exudates and splenic cells for quantification of cytokines, nitrogen and oxygen intermediary compounds. The trial was divided into four phases: In the first, the donors were registered in the hospital and human milk was home collected; hygiene-sanitary quality was determined by means of total coliform, total aerobe mesophyll and Staphylococcus aureus quantification and pH determination in raw and pasteurized human milk samples. In the second phase, seven bifid bacteria strains (UFVCC 1083, 1091, 1099, 1103, 1105, 1108 and 1111) were selected to compose the probiotic pool that was added to the pasteurized milk fed daily to the animals. In the third phase of the experiment, 48 21-to-23 day old Wistar females were used in each repetition, divided into four experimental groups: Basal; Control (diet); PM (pasteurized human milk) and BAPM (pasteurized human milk added bifid bacteria). The four animals composing the basal group were sacrificed on the first day of the experiment (T0) and the animals composing the other groups were daily fed different diets (0.1 mL) orally using sterilized micro pipettes during 21 days and later sacrificed; pH was determined and the modulation of the microbial groups present in the cecal region was verified by means of determining bifid bacteria, clostridia, Lactobacillus spp., total coliform and total aerobe mesophyll counts, together with histomorphometric analysis of the ascending colon region of these animals by determining the intestinal crypt depth; finally, in the fourth phase of the experiment, 36 Wistar females were used and daily fed (0.1 mL) orally, using sterilized micropipettes, under different treatments, as follows: Control (diet); PM (pasteurized human milk) and BAPM (pasteurized human milk added bifid bacteria), during 30 days. These animals were later killed to determine immunological response by means of determination of the cytokines IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-α; cellular cytotoxicity, determination of nitrogen (NO), and oxygen (H2O2) intermediary compounds in the supernatant of the peritoneal and splenic exudate cells. It was concluded that despite the pasteurization process efficiency for pathogens verified in this study, donors are urgently advised to become aware of the methods used for human milk collection. More rigorous monitoring measures of hygiene-sanitary quality control should be adopted for human milk collected at home, since such measures are essential to ensure safe food for the newly born. A medium increase in the crypt length was verified with age, being more pronounced in the animal group fed pasteurized milk (PM) and the results also showed that the addition of bifid bacteria to the human milk (BAPM) did not present any risk of altering ascending colon histomorphometry, as to the parameter evaluated. Such information underlies the fact that adding bifid bacteria to pasteurized milk in the human milk banks does not interfere in epithelium integrity and has a potential to benefit the children who need to make use of this alternative. It was also concluded that bifid bacteria added to pasteurized milk (BAPM) exerted an antagonist effect for total coliforms in micro biota modulation in the cecal content, compared to the other treatments (PM and control). It was also verified that the bifid bacteria did not present oral toxicity in relation to macrophage viability and did not promote any adverse effect on the health of the animals tested. Finally, adding bifid bacteria to the diet has influenced the immunological system of the animals by releasing the mediators presented. The accumulation of information on the beneficial effects of these probiotic bacteria has justified their addition to several products, including pasteurized milk, under the form of frozen concentrated human milk found in the human milk banks, offered as an alternative by the Brazilian public health system. The evidences showing the benefits originated from the use of probiotic bifid bacteria justify further studies on their mode of action, in order to optimize their use as prophylactic and immune modulating agents.