Variabilidade molecular e resistência a geminivirus em acessos de tomateiro do BGH-UFV

Abstract

O Banco de Germoplasma de Hortaliças (BGH) da Universidade Federal de Viçosa, mantém cerca de 870 acessos do gênero Lycopersicon, muitos deles ainda não caracterizados. Essa cultura é atacada por inúmeras pragas, onde a mosca-branca (Bemisia tabaci) é considerada uma das mais importantes. A partir de 1994, ocorreu a introdução de um novo biótipo de B. tabaci no Brasil (biótipo B), responsável pela disseminação de novas espécies de begomovírus em tomateiro. Uma dessas novas espécies, o Tomato yellow spot virus (ToYSV), causa sintomas severos e com alta precocidade no tomateiro. Dentro deste contexto, nosso trabalho teve como objetivos: (1) avaliar 96 acessos de tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) quanto a resistência ao gemivirus Tomato yellow spot virus (ToYSV) e (2) caracterizar a variabilidade genética a partir de dados moleculares. A resistência ao ToYSV foi avaliada através de uma triagem, sendo inoculados os acessos via agroinoculação e via biobalística, empregando o isolado de ToYSV Bi2. Como resultado dessa triagem foi selecionado os acessos que manifestaram o maior padrão de resistência e foram novamente inoculados. Os acessos que se manifestaram como resistentes foram selecionados novamente e inoculados baixo as mesmas condições, sendo plantadas 20 plantas por acessos. Foi avaliada a presencia do vírus de modo visual aos 10, 20 e 30 dias após inoculação. Foi confirmada a avaliação visual via PCR e hibridização. Os acessos foram fenotipados tendo como base a porcentagem de plantas infectadas confirmadas por PCR e hibridização, do total de plantas inoculadas. A variabilidade molecular foi caracterizada empregando marcadores moleculares ISSR. Os acessos foram semeados em casa de vegetação e folhas de três plantas por acesso foram coletadas para extração em bulk do DNA. Dez marcadores moleculares ISSR ancorados foram empregados. As bandas analisadas para cada primer empregado permitiu a construção da matriz de dados binários. A matriz foi empregada no calculo da dissimilaridade utilizando o complemento do coeficiente de similaridade de Jaccard. A matriz foi empregada na realização dos agrupamentos pelo método de otimização de Tocher e hierárquico UPGMA. Dos 96 acessos inoculados via agroinoculação, foram seleccionados 31 acessos classificados como Altamente Resistente (AR), sendo inoculados via biobalística e selecionados dentre deles 4 acessos. Os 4 acessos selecionados foram inoculados novamente e como resultado destacou-se o acesso BGH-224 que foi classificado como AR, com apenas 10% de plantas infectadas, e indicado como acesso promissor para obtenção de cultivares com resistência ao ToYSV. Os marcadores ISSR geraram, em conjunto, 53 bandas polimórficas de um total de 144 amplificadas. O primer 840 gerou o maior número de bandas polimórficas, com 18 % (13 bandas) das 144 bandas obtidas pelos 10 primers empregados. O tamanho dos fragmentos amplificados variou de 250 a 2000 pb. Mediante a avaliação do dendrograma obtido pelo método de agrupamento UPGMA e o agrupamento pelo método Tocher, foi possível diferenciar os acessos. O acesso BGH-980 foi classificado isoladamente, sendo o mais divergente dos acessos testados. Foram classificados em grupos de 2 acessos os pares de acessos BGH-674 e BGH-991, BGH-616 e BGH-970, ainda que semelhantes não constituem acessos duplicados. Os marcadores ISSR foram úteis na caracterização da variabilidade dos acessos de Lycopersicon esculentum, amplificando número relativamente elevado de locos por primer, sendo suficiente para discriminar os acessos valiados.

The Bank of Germplasm of Vegetables (BGH) of the Federal University of Viçosa, it maintains about 870 accesses of the gender Lycopersicon, many of them still no characterized. That culture is attacked by countless curses, where the flywhite (Bemisia tabaci) one of the most important is considered. Starting from 1994, it happened the introduction of a new biotype of B. tabaci in Brazil (biotype B), responsible for the spread of new begomovírus species in tomato. One of those new species, Tomato yellow spot virus (ToYSV), it causes severe symptoms and with high precocity in the tomato. Inside of this context, our work had as objectives: (1) to evaluate 96 tomato accesses (Lycopersicon esculentum Mill.) as the resistance to the gemivirus Tomato yellow spot virus and (2) to characterize the genetic variability starting from molecular data. The resistance to ToYSV was evaluated through a selection being inoculated the accesses through agroinoculação and he saw biobalística, using the isolated of ToYSV Bi2. As a result of that selection it was selected the accesses that manifested the largest resistance pattern and again inoculated. The accesses that showed as resistant they were selected again and inoculated the same conditions low, being planted 20 plants by accesses. It was evaluated her witnesses from the virus in a visual way to the 10, 20 and 30 days after inoculation. The visual evaluation was confirmed through PCR and hybridization. The accesses were fenotipados tends as base the percentage of infected plants confirmed by PCR and hybridization, of the total of inoculated plants. The molecular variability was characterized using molecular markers ISSR. The accesses were sowed in vegetation house and leaves of three plants by access were collected for extraction in bulk of DNA. Ten molecular markers anchored ISSR were used. The bands analyzed for each employed primer allowed the construction of the head office of binary data. The head office was used in I calculate it of the dissimilar using the complement of the coefficient of similarity of Jaccard. The head office was used in the accomplishment of the groupings by the method of optimization of Tocher and hierarchical UPGMA. Of the 96 accesses inoculated through agroinoculação, 31 accesses were selected classified as highly resistant (AR), being inoculated through biobalistica and selected among of them 4 accesses. The 4 selected accesses were inoculated again and as result he stood out the access BGH-224 that was classified as AR with only 10% of infected plants, and suitable as promising access for obtaining of you cultivate with resistance to ToYSV. The markers ISSR generated, together, 53 bands polymorphic of a total of 144 amplified. The primer 840 generated the largest number of bands polimórficas, with 18% (13 bands) of the 144 bands obtained by the 10 used primers. The size of the amplified fragments varied from 250 to 2000 pb. By the evaluation of the dendrogram obtained by the grouping method UPGMA and the grouping for the method Tocher, it was possible to differentiate the accesses. The access BGH- 980 was classified separately, being the most divergent of the tested accesses. They were classified in groups of 2 accesses the equal of accesses BGH- 674 and BGH-991, BGH-616 and BGH-970, that constitute duplicated accesses. The markers ISSR were useful in the characterization of the variability of the accesses of Lycopersicon esculentum, amplifying relatively high number of locos for primer, being enough to discriminate the appraised accesses.