Use este identificador para citar ou linkar para este item:
https://locus.ufv.br//handle/123456789/4436
Tipo: | Dissertação |
Título: | Produção e avaliação de anti-soro policlonal visando a detecção do Pepper yellow mosaic virus |
Título(s) alternativo(s): | Production and evaluation of polyclonal antisera for the detection of Pepper yellow mosaic virus |
Autor(es): | Nogueira, Diêgo Rodrigues Soares |
Primeiro Orientador: | Zerbini Júnior, Francisco Murilo |
Primeiro coorientador: | Zerbini, Poliane Alfenas |
Primeiro avaliador: | Cunha, Luis Claudio Vieira da |
Segundo avaliador: | Lima, Alison Talis Martins |
Abstract: | O Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), agente causal do mosaico amarelo do pimentão e do tomateiro, desde seu primeiro relato no Brasil no ano de 2002 em Brasília, DF, vem se disseminando em regiões produtoras de pimentão e tomate causando perdas substanciais ao produtores dessas culturas. Para identificação dessa enfermidade algumas ferramentas são utilizadas, dentre elas, podemos destacar os métodos moleculares e sorológicos, sendo estes últimos mais utilizados por apresentarem alta especificidade e sensibilidade, além de possuir um custo relativamente baixo. Para a produção de anti-soro, tradicionalmente, utilizam-se partículas virais concentradas como imunógenos. No entanto, o processo de purificação é muito trabalhoso e pode apresentar pureza e concentrações insatisfatórias. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi produzir um anti-soro policlonal, a partir da proteína capsidial recombinante do PepYMV, que permita sua utilização tanto para diagnose quanto para estudos de interação da proteína capsidial do PepYMV com outras proteínas virais e fatores do hospedeiro. A sequência do gene da proteína capsidial do PepYMV foi clonada em vetor de expressão (pRSET-A) e transformada em Escherichia coli, linhagem BL21::DE3, para expressão in vitro. A proteína expressa fusionada a uma cauda de histidina foi purificada sob condições desnaturantes por cromatografia de afinidade em coluna de resina Ni-NTA. Em seguida a proteína purificada foi dialisada sob condições renaturantes e sua integridade e identidade foram confirmadas por gel de poliacrilamida a 12% e análise de espectrometria de massa. Dois coelhos da raça Nova Zelândia foram imunizados com quantidades crescentes da proteína recombinante dialisada adicionados do adjuvante de Freud incompleto na proporção 1:1. A sensibilidade e a especificidade do anti-soro foram testados por Western blot e ELISA indireto. O anti-soro produzido apresentou boa especificidade e sensibilidade, provando ser uma ferramenta confiável para a diagnose do PepYMV. Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) naturally infects sweet pepper and tomato plants, leading to severe losses since its first report in Brazil (Brasília, DF, 2002). Molecular and serological methods can be used to detect the pathogen. Serological methods for viral detection require the use of a high quality antiserum, offering good sensitivity and specificity. Traditionally, purified viral particles are used as immunogens. However, the purification process is very laborious and the final preparation may have unsatisfactory purity and/or concentration. Thus, the aim of this work was to produce a polyclonal antiserum against the recombinant capsid protein (CP) of PepYMV to allow its use both for diagnosis and for studies of the interaction of the PepYMV CP with other viral proteins and host factors. The coding sequence of the capsid protein gene of PepYMV was cloned into an expression vector (pRSET-A) and transformed into Escherichia coli strain BL21::DE3 for in vitro expression. The recombinant protein, fused to a histidine tag, was purified under denaturing conditions by affinity chromatography using a Ni-NTA column. The purified recombinant protein was dialyzed under renaturing conditions. Its integrity and identity were confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometer analyses. New Zealand rabbits were immunized with increasing amounts of the recombinant protein. The sensitivity and specificity of the antisera were analyzed by Western blot and indirect ELISA assays. The antisera raised against the recombinant CP showed good specificity and sensibility, proving to be a reliable tool for the detection of PepYMV. |
Palavras-chave: | Fitopatologia Hortaliças - Doenças e pragas Pepper yellow mosaic virus Pimentão - Doenças e pragas Tomate - Doenças e pragas Plant pathology Vegetables - Diseases and pests Pepper yellow mosaic virus Chili - Diseases and pests Tomato - Diseases and pests |
CNPq: | CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::AGRONOMIA::FITOSSANIDADE::FITOPATOLOGIA |
Idioma: | por |
País: | BR |
Editor: | Universidade Federal de Viçosa |
Sigla da Instituição: | UFV |
Departamento: | Etiologia; Epidemiologia; Controle |
Citação: | NOGUEIRA, Diêgo Rodrigues Soares. Production and evaluation of polyclonal antisera for the detection of Pepper yellow mosaic virus. 2014. 45 f. Dissertação (Mestrado em Etiologia; Epidemiologia; Controle) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2014. |
Tipo de Acesso: | Acesso Aberto |
URI: | http://locus.ufv.br/handle/123456789/4436 |
Data do documento: | 11-Mar-2014 |
Aparece nas coleções: | Fitopatologia |
Arquivos associados a este item:
Arquivo | Descrição | Tamanho | Formato | |
---|---|---|---|---|
texto completo.pdf | 734,85 kB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |
Os itens no repositório estão protegidos por copyright, com todos os direitos reservados, salvo quando é indicado o contrário.