Influência de inibidores proteicos e não-proteicos de proteases digestivas e caracterização bioquímico-cinética de cisteíno-proteases parcialmente purificadas de Anticarsia gemmatalis

Abstract

Os inibidores de proteases têm efeito protetor de plantas contra danos causados por vários tipos de pragas agrícolas, inibindo, significativamente, a atividade proteolítica de enzimas presentes no intestino dos insetos. A ingestão de inibidores de proteases leva os insetos a utilizarem aminoácidos livres na síntese de mais proteases digestivas, com a finalidade de compensar as formas dessas enzimas indisponíveis à catálise, justamente por estas estarem na forma do complexo enzima-inibidor (EI). Consequentemente, ao invés de utilizarem os aminoácidos biodisponíveis para a síntese de proteínas necessárias ao seu crescimento, desenvolvimento, manutenção e reprodução os insetos usam sua reserva aminoacídica para a biossíntese de novas proteases para realizar a hidrólise de sua dieta proteica. A caracterização bioquímica e cinética de enzimas hidrolíticas presentes no intestino de insetos tem sido realizada para se entender o complexo sistema de proteases dos insetos sob o ponto de vista da relação estrutura/função. Dessa forma, os centros ativos de tais enzimas poderão ser mapeados através de cinética enzimática e química de proteínas, com o objetivo de produzir inibidores específicos para cada protease. Neste trabalho foram selecionados os inibidores de proteases SBBI, SKTI e E-64, a fim de avaliar seus efeitos sobre o desenvolvimento larval de Anticarsia gemmatalis e sobre a atividade de algumas enzimas digestivas, tais como proteases totais, serino-proteases tripsinas-like e cisteíno-proteases. Esses inibidores foram adicionados individualmente na dieta artificial na concentração de 0,1% (p/v) e lagartas de 1º ínstar foram alimentadas até completarem seu ciclo larval. Os três inibidores utilizados causaram prejuízo no desenvolvimento de larvas de A. gemmatalis, aumentando o ciclo larval e afetando o ganho de peso dessas larvas até a fase pupal. A concentração de IP s utilizada foi insuficiente para causar efeito inibitório das proteases presentes no intestino de A. gemmatalis. Porém o perfil de proteases coincidiu com o perfil das proteases específicas tripsina-like e cisteíno-proteases, sendo que as serino-proteases apresentaram maior atividade do que as cisteíno-proteases. Foi realizada também a purificação parcial de cisteíno-proteases do intestino médio de Anticarsia gemmatalis utilizando-se precipitação diferencial com 30 60% de (NH4)2SO4 e cromatografia de afinidade com coluna de aprotinina-agarose. As proteínas não ligadas à coluna, ou seja, todas as proteínas presentes no extrato bruto com exceção das serinoproteases ligadas à aprotinina-agarose, que apresentaram atividade proteolítica, foram reunidas num pool enzimático e caracterizadas utilizando o substrato sintético L-BApNA na presença do inibidor de serino-proteases benzamidina. Observaram-se picos de atividade nos valores de pH 4,0, 5,5 e 8,0, sendo o pH 8,0 o de melhor atividade. Com relação à influência da temperatura, observaram-se dois picos mais discretos de atividade a 20ºC e entre 35 45ºC, e um pico de atividade pronunciada na faixa entre 55 60ºC. O KM app obtido foi de 0,74 mM e a Vmax app foi 0,8 M.min-1. A análise do efeito de íons cálcio mostrou que as cisteíno-proteases parcialmente purificadas são cálcio-dependentes e apresentaram melhor atividade em 30 mM de CaCl2. A presença do inibidor de serino-proteases benzamidina e do agente redutor DTT no meio reacional, juntamente com os dois inibidores de serino-proteases aprotinina e TLCK comprovam a atividade de cisteíno-proteases testadas no presente trabalho.

The protease inhibitors have protective effect of plants against damage from various types of agricultural pests, inhibiting significantly the activity of proteolytic enzymes in the gut of insects. Ingestion of protease inhibitors leads insects to use free amino acids in the synthesis of more digestive proteases, in order to compensate forms of these enzymes unavailable to catalysis, precisely because they are in the form of enzyme-inhibitor complex (EI). Consequently, instead of using bioavailable amino acids for synthesis of proteins necessary for growth, development, maintenance and breeding, insects using the amino acid reservation for biosynthesis of new proteases to perform the hydrolysis of the diet protein. The biochemical and kinetic characterization of hydrolytic enzymes in the gut of insects has been made to understand the complex system of proteases of insects from the view of the structure/function. Thus, the active centers of these enzymes can be mapped through enzyme kinetics and protein chemistry, with the goal of producing protease inhibitors specific for each. In this work we selected protease inhibitors SBBI, SKTI and E-64 in order to evaluate its effects on larval development of Anticarsia gemmatalis and on the activity of some digestive enzymes such as total proteases, trypsin-like serine proteases and cysteine proteases. These inhibitors were added individually on artificial diet at a concentration of 0.1% (w/v) and first instar larvae were fed to complete their larval cycle. The three inhibitors used caused injury in the development of larvae of A. gemmatalis, increasing the larval cycle and affecting the weight gain of the larvae to the pupal stage. The concentration of PI used was insufficient to cause the inhibitory effect of proteases present in the gut of A. gemmatalis. But the profile of proteases coincided with the profile of specific proteases trypsin-like and cysteine proteases, and the activity serine-proteases were higher than cysteine proteases. It was also done partial purification of midgut cysteine proteases of Anticarsia gemmatalis using differential precipitation with 30 - 60% (NH4)2SO4 and affinity chromatography with aprotinin-agarose column. The proteins not bound to the column, ie all the proteins present in the crude extract with the exception of serine proteases associated with aprotinin-agarose, which showed proteolytic activity were pooled enzyme and characterized using the synthetic substrate L-BApNA in the presence the serine protease inhibitor benzamidine. Observed peak activity at pH values 4.0, 5.5 and 8.0, being the best activity in pH 8.0. Regarding the influence of temperature, we observed two more discrete peaks activity at 20°C and between 35 - 45ºC, and a pronounced peak of activity 55 - 60ºC. The KM app obtained was 0.74 mM and Vmax app was 0.8 μM.min-1. Analysis of the calcium ions effect showed that partially purified cysteine proteases are calcium-dependent and showed a better activity in 30 mM CaCl2. The presence of the serine protease inhibitor benzamidine and the reducing agent DTT in the reaction medium together with the two inhibitors of serine proteases TLCK and aprotinin proved the activity of cysteine proteases tested in this study.