Serine-arginine protein kinases (SRPKs) como potencial alvo de fármacos em Leishmania braziliensis

Abstract

As leishmanioses representam uma das sete doenças tropicais mais importantes, sendo um grave problema de saúde mundial. As terapias disponíveis são problemáticas, tornando-se de grande interesse a identificação e validação de novos alvos, para desenvolvimento de terapias mais seletivas e eficazes. As serine-arginine protein kinases (SRPKs) se destacam como alvos promissores. SRPKs participam de processos celulares importantes, como o processamento do mRNA, onde atuam regulando as proteínas SR (fatores de splicing). Diante disto, este trabalho teve como objetivo identificar possíveis SRPKs e proteínas SR em Leishmania braziliensis através de análises bioinformáticas, clonar as sequências que codificam tais proteínas, expressar e purificar as proteínas recombinantes, bem como avaliar o efeito leishmanicida de compostos desenhados para atuarem como inibidores de SRPKs. As análises de bioinformática identificaram pelo menos uma possível SRPK e uma possível proteína SR em L. braziliensis. As sequências que codificam as proteínas foram clonadas em vetor pET-28a para expressão em Escherichia coli e tiveram sua expressão padronizada. Com a purificação por afinidade, as proteínas foram parcialmente purificadas, observando-se a necessidade do uso de outras técnicas para se obter um grau de pureza mais elevado. Através do docking vimos que o SRVIC22 e SRVIC32 podem interagir com a proteína no seu sítio de ligação de ATP e, embora não apresentem os maiores valores de docking score, algumas características físico-químicas ajudam a explicar sua melhor atividade in vitro. Quando utilizados em conjunto os compostos não foram tóxicos para os macrófagos e foram capazes de reduzir a infecção, in vitro, de macrófagos por L. braziliensis. O tratamento com o composto SRVIC32 ou com a combinação dos compostos (SRVIC22+SRVIC32) também levaram à uma alteração no nível de expressão da possível SRPK. A avaliação da toxicidade dos compostos in vivo mostrou que, embora as análises bioquímicas do sangue não apresentassem alteração, na maior dose utilizada foram observadas algumas alterações histológicas no fígado. A obtenção das proteínas purificadas permitirá a realização de ensaios para caracterização bioquímica, que poderão confirmar se são uma SRPK e uma proteína SR genuínas, e para a validação da SRPK como alvo terapêutico. Dentre os compostos, o SRVIC32 se mostrou um candidato mais promissor, podendo ser melhor explorado na busca por novas terapias contra a leishmaniose.

Leishmaniasis are one of the seven more important tropical diseases, it been a serious health problem worldwide. The available therapies are problematic, so is interesting the identification and validation of new targets for new therapies more selective and effective. The serine-arginine protein kinases (SRPKs) sand out as promising targets. SRPKs are involved in important cellular process such as mRNA processing, where they acting regulating SR proteins (splicing factors). Therefore, this work aimed the identification of possible SRPKs and SR proteins in Leishmania braziliensis by the bioinformatics analysis, cloning the sequences that code that proteins, and express and purify the recombinants proteins, as well as evaluate the leishmanicidal effect of compounds designed to act as SRPKs inhibitors. Bioinformatics analysis identified at least one possible SRPK and one possible SR protein in L. braziliensis. These sequences were cloned in pET-28a vectors to express in Escherichia coli and had their expressions standardized. With affinity purification the proteins were partially purified, observing the need to use others techniques to obtain a higher purity degree. By docking we found that, SRVIC22 and SRVIC32 can interact with the protein in ATP ligation site and although they do not present the higher values of docking score, some physical- chemical characteristics help to explain they better in vitro activity. When we used the compounds together, there wasn’t cytotoxicity in macrophages, but they were be able to reduce in vitro infection of macrophages by L. braziliensis. The treatment only with SRVIC32 or with the compounds together (SRVIC22+SRVIC32) also led to alteration in an expression degree of possible SRPK. The in vivo toxicity evaluation of compounds showed that, although the blood biochemistry analysis didn’t presented alteration, with the higher dose used were observed some histologic alterations on liver. The obtaining of purified proteins will permit make biochemistry characterization assays, which may confirm if those proteins are really SRPK and SR protein and to validate SRPK as therapeutic target. Between the compounds, the SRVIC32 showed a promisor candidate, being able better explored on search by new therapies against leishmaniasis.