Purificação e caracterização bioquímica de β-glicosidases de Penicillium chrysogenum e sua aplicação na suplementação de coquetéis enzimáticos para a hidrólise de biomassas

Abstract

β-glicosidases tem recebido atenção em vários campos por causa de suas aplicações práticas. Assim, os objetivos deste trabalho foram estabelecer as condições de cultivo de P. chrysogenum em meio liquido contendo farelo de trigo como fonte de carbono, purificar e caracterizar as β-glicosidases secretadas. O sobrenadante da cultura foi submetido a precipitação por sulfato de amônio e cromatografia de interação hidrofóbica. Duas β-glicosidases foram encontradas, PcβGlu1 e PcβGlu2. Para melhor purificação PcβGlu2 foi submetida à cromatografia de exclusão molecular. PcβGlu1 demonstrou ser mais estável que PcβGlu2 quando colocada a altas temperaturas e as duas apresentaram atividade ótima em pH 5,0. PcβGlu1 e PcβGlu2 possuem massas moleculares nativas de 241 kDa e 95 kDa, respectivamente. A determinação da configuração do carbono anomérico demonstrou que as enzimas atuam sobre seus substratos pelo mecanismo de retenção de configuração. A atividade de PcβGlu2 foi mais inibida pelos íons Cu 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ e Hg + a 10 mM que PcβGlu1. PcβGlu1 demonstrou cinética Micheliana para todos os substratos testados com valores de K M variando de 0.09 ± 0.01 (laminarina) a 1.7 ± 0.1 mM (C2). PcβGlu2 demonstrou inibição pelos substratos MUβGli, pNPβGli, celodextrinas (C3, C4 and C5), octilβGli e Lb, com valores de K M variando de 0.014 ± 0.001 (MUGβGli) a 0.64 ± 0.06 mM (Cb). As duas enzimas foram inibidas de forma competitiva por glicose e de acordo com um modelo de inibição mista por celobiose quando pNPβGli foi utilizado como substrato, sendo PcβGlu2 mais inibida que PcβGlu1. PcβGlu1 foi identificada com 15% de cobertura como produto codificado pelo gene Pc18g01940 e PcβGlu2 foi identificada como produto codificado pelo gene 20g10170 com 3,5 % de cobertura. As duas enzimas possuem maiores afinifidade de ligação para resíduos de glicose nos subsítios -1 e +1. Comparando as duas enzimas, PcβGlu2 possui maior potencial para aplicação em hidrólise de biomassa, visto que foi capaz de hidrolisar biomassas sem a adição de enzimas suplementares.

β-glucosidases have received attention in many fields, mainly because of their practical applications. The objectives of this work were to stablish the best conditions for P. chrysogenum cultivation in submerged culture containing wheat bran as carbon source and the purification and characterization of β-glucosidases found. The culture supernatant was subjected to ammonium sulphate precipitation and hydrophobic interaction chromatography. Two β-glucosidases were found, PcβGlu1 and PcβGlu2. For further purification, PcβGlu2 was subjected to gel filtration chromatography. PcβGlu1 was more stable than PcβGlu2 when subjected to high temperatures and both have optimum activity at pH 5.0. PcβGlu1 and PcβGlu2 have respective native molecular masses of 241 kDa and 95 kDa (gel filtration). The determination of anomeric carbon configuration demonstrates that enzymes hydrolyze their substrates with retention of configuration. The PcβGlu2 activity was more inhibited for Cu 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ e Hg + at 10 mM than PcβGLu1. PcβGlu1 showed Michaelian-Menten kinetics for all substrates tested with K M values ranging from 0.09 ± 0.01 (laminarin) to 1.7 ± 0.1 mM (C2). PcβGlu2 showed substrate inhibition for MUβGlu, pNPβGlu, cellodextrins (C3, C4 and C5), octilβGlu and Lb, with K M values ranging from 0.014 ± 0.001 (MUβGlu) to 0.64 ± 0.06 mM (Cb). Glucose is competitive inhibitor and celobiose is a mixed-type inhibitor of PcβGlu1 and PcβGlu2 when pNPβGlu is used as substrate. PcβGlu2 was more inhibited than PcβGlu1for both inhibitors. PcβGlu1 was identified with 15% of coverage as the product coded by the gene Pc18g01940 and PcβGlu2 was identified as as the product coded by the gene Pc20g10170 with 3,5 % of coverage. The two enzymes bind glucosyl residues with more affinity at -1 and +1 subsites. Comparing the two enzymes PcβGlu2 has more pontetial to be applied on biomass hydrolysis because it was able to hydrolyse several sources of biomass without addition of supplementary enzymes.