Diversidade de bactérias láticas e identificação molecular de Lactococcus isolados de ambientes lácteos e não lácteos

Abstract

Ambientes lácteos como queijos artesanais e leite cru são considerados excelentes fontes para isolamento de LAB com características específicas que podem ser utilizadas na indústria de fermentados. Porém, fontes não lácteas também podem fornecer isolados com características interessantes que podem, ser aproveitadas em produtos lácteos. Este trabalho teve início com o estudo da diversidade da microbiota de queijos artesanais da região amazônica durante as diferentes estações do ano. Para isso, foram realizadas contagens de BAL em meios específicos e análise de cultura-independente, que avalia de forma mais ampla a presença de bactérias láticas e de outros grupos que possam estar presentes. O cultivo de BAL a partir dos queijos permitiu a obtenção de um vasto banco de culturas láticas a serem estudadas e caracterizadas. A análise de cultura– independente TTGE mostrou a diversidade e a presença de diferentes bactérias láticas, outros gêneros poucos encontrados em queijos e até mesmo bactérias citadas na literatura como comuns em infecções do trato urinário. A análise dos resultados do TTGE revelou a similaridade entre os perfis de bandas dos queijos coletados no período seco e no período chuvoso mostrando que os queijos que apresentam maior similaridade foram coletados no mesmo período do ano e que possivelmente o clima contribui para a microbiota dominante em cada um deles. Dentre os grupos de bactérias isoladas a partir dos queijos artesanais, Lactococcus lactis foi estudado com maior detalhe devido à sua importância como cultura starter na indústria de alimentos. Os isolados identificados como Lactococcus lactis foram incorporados a uma coleção da mesma espécie isoladas a partir de diferentes fontes lácteas e não-lácteas, que foram submetidas a um estudo por MLST para um melhor entendimento sobre a diversidade genética entre esses isolados. Para isso, um total de 23 isolados foram submetidos às análises de REP-PCR e PFGE, onde a presença ou não de clones foi estudada. Tendo sido os 23 isolados considerados diferentes, pode-se realizar a análise de MLST com um esquema desenvolvido anteriormente para esse gênero. A análise revelou a existência de novas sequências STs que nunca haviam sido relatadas no banco de dados criado para esta espécie dentro desse esquema e abriu a possibilidade de que esses isolados poderiam ter características tecnológicas interessantes para aplicação na indústria. Após o estudo relacionado à diversidade genética dos isolados, foi necessário avaliar as características fenotípicas dessas culturas, visando sua aplicação em produtos lácteos. Testes fenotípicos para avaliação de perfil de fermentação, capacidade de desenvolvimento em diferentes concentrações de NaCl, produção de diacetil, presença de genes importantes para característica de bioproteção e outras características foram avaliadas neste estudo com o intuito caracterizar fenotipicamente essas estirpes e direcionar seu potencial de aplicação na indústria. Como resultado, algumas estirpes apresentaram potencial antagonista para os patógenos testados sendo esse resultado extremamente importante para pesquisas futuras. Quanto as demais características estudadas, os isolados apresentaram resultados satisfatórios que viabilizariam sua utilização como cultura starter ou como culturas bioprotetoras caso a expressão de genes para produção de nisina seja confirmada.Este trabalho permitiu compreender a diversidade microbiana presente nos queijos artesanais, suas variações durante diferentes épocas do ano assim como a importância do estudo de bactérias como Lactoccus lactis que podem ter uma grande variabilidade dentro da própria espécie contribuindo assim, para características diferenciadas de fermentação e outras funções importantes em alimentos. Esses resultados vão auxiliar nos próximos estudos que poderão entender mais detalhadamente a aplicação adequada para cada isolado caracterizado e a potencialização das características desse isolado que poderão ser benéficas para a indústria.

Dairy environments such as artisanal cheeses and raw milk are considered excellent sources for LAB isolation with specific characteristics that can be used in the fermented industry. However, non-dairy sources can also provide isolates with interesting characteristics that can be used in dairy products. This work began with the study of the microbial diversity of artisanal cheeses from the Amazon region during the different seasons of the year. For this, BAL counts were performed in specific media and culture-independent analysis, which evaluates in a broader way the presence of lactic bacteria and other groups that may be present. The cultivation of BAL from the cheeses allowed to obtain a vast bank of lactic cultures to be studied, characterized and in the future applied in fermented foods. The culture- independent TTGE analysis showed the diversity and presence of different lactic bacteria, other genera few found in cheeses and even bacteria cited in the literature as common in urinary tract infections. The analysis of the TTGE results revealed the similarity between the bands profiles of the cheeses collected during the dry period and in the rainy season, showing that cheeses with the highest similarity were collected in the same period of the year and that the climate possibly contributes to the dominant microbiota in each one of them. Among the groups of bacteria isolated from artisanal cheeses, Lactococcus lactis was studied in greater detail due to its importance as a starter culture in the food industry. The isolates identified as Lactococcus lactis were incorporated into a collection of the same species isolated from different dairy and non-dairy sources, which were submitted to a study by MLST for a better understanding of the genetic diversity among these isolates. For this, a total of 23 isolates were submitted to REP-PCR and PFGE analyzes, where the presence or not of clones was studied. Since the 23 isolates were considered different, the MLST analysis can be performed with a previously developed scheme for this genera. The analysis revealed the existence of new ST sequences that had never been reported in the database created for this species within this scheme and opened the possibility that these isolates could have interesting technological features for application in the industry. After the study related to the genetic diversity of the isolates, it was necessary to evaluate the phenotypic characteristics of these cultures, aiming their application in dairy products. Phenotypic tests for evaluation of fermentation profile, developmental capacity at different concentrations of NaCl, diacetyl production, presence of important genes for bioprotection characteristics and other characteristics were evaluated in this study with the purpose of characterizing phenotypically these strains and directing their application potential industry. As a result, some strains showed antagonistic potential for the pathogens tested and this result is extremely important for future research. Regarding the other characteristics studied, the isolates presented satisfactory results that could be used as starter culture or as bioprotective cultures if the expression of genes for nisin production is confirmed. his work allowed to understand the microbial diversity present in the artisanal cheeses, their variations during different times of the year, as well as the importance of the study of bacteria such as Lactoccus lactis that can have a great variability within the species itself, thus contributing to differentiated characteristics of fermentation and other important functions in food. These results will aid in the next studies that will be able to understand in more detail the suitable application for each characterized isolate and the potentialization of the characteristics of this isolate that could be beneficial for the industry.