Comparing the responses of rumen ciliate protozoa and bacteria to excess glucose

Abstract

Rumen microbes hold a central role in ruminant nutrition. They ferment feed components to produce volatile fatty acids (VFA) and grow (synthesize microbial protein), which supplies the greater part of energy and amino acids required by the animals. However, when given excess carbohydrate, microbes growth efficiency becomes low because microbes direct energy to non-growth functions, instead of using it for growth. Different microorganisms respond to this excess in different ways. Certain species respond by storing energy (synthesizing reserve carbohydrate), but other species respond by dissipating the energy as heat (spilling energy). To determine the relative importance of these responses in the microbial community of the rumen, this study aims to quantify how mixed ciliate protozoa and bacteria respond to glucose. It was hypothesized that ciliate protozoa would direct more glucose to synthesis of reserve carbohydrate and less to energy spilling than would bacteria. Ciliates and bacteria were isolated from rumen fluid using filtration and centrifugation, respectively. Posteriorly, ciliates and bacteria were resuspended in nitrogen-free buffer to limit growth and dosed with 5 mM glucose. Samples were collected over time and were subsequently divided in pellet (cells) and supernatant by centrifugation. Pellet samples were analyzed for reserve carbohydrate and protein, while supernatant sample were analyzed for free glucose, D- /L-lactic acid, acetic acid, propionate and butyrate. Additionally, were analyzed heat production and fermentation gases (H 2 , CH 4 and CO 2 ). Endogenous metabolism, reserve carbohydrate synthesis and energy spilling were calculated from the data obtained from the analysis data. Most data were analyzed using PROC GLIMMIX of SAS. Student’s t- test was used to separate means or determine if means differed from 100%. Local regression (LOCFIT package of R; Loader, 1999) was used to fit time-series data to smooth curves. Compared to bacteria, ciliates consumed glucose more than 3-fold faster and synthesized reserve carbohydrate 4-fold faster. They incorporated 53% of glucose carbon into reserve carbohydrate, nearly double the value (27%) for bacteria. Energy spilling was not detected for ciliates, as all heat production was accounted by synthesis of reserve carbohydrate and endogenous metabolism. For bacteria, reserve carbohydrate and endogenous metabolism accounted for only 68% of heat production, thus they spilled large amounts of energy (32% of total heat production). These results suggest that rumen ciliates protozoa alter the course of carbohydrate metabolism in the rumen by consuming glucose more rapidly and outcompeting bacteria for excess carbohydrate. This action of the ciliates in the rumen likely maximizes reserve carbohydrate synthesis while minimizing spilling.

Os microrganismos ruminais têm um papel central na nutrição de ruminantes. Eles têm a capacidade de fermentar componentes do alimento para produzir ácidos graxos voláteis (AGV’s) e crescer (sintetizar proteína microbiana), os quais fornecem a maior parte da energia e aminoácidos exigidos pelos animais. No entanto, quando são fornecidos carboidratos em excesso, a eficiência de crescimento dos microrganismos torna-se baixa porque estes direcionam a energia para outras funções, ao invés de a utilizarem para o crescimento. Diferentes microrganismos respondem a esse excesso de maneiras diferentes. Certas espécies respondem armazenando energia (sintetizando carboidratos de reserva), mas outras espécies respondem dissipando a energia na forma de calor. Para determinar a importância relativa dessas respostas na comunidade microbiana do rúmen, este estudo foi cinduzido com o objetivo de quantificar como os protozoários ciliados e as bactérias responderam à glicose. Teve-se como hipótese que os protozoários ciliados direcionariam mais glicose para a síntese de carboidratos de reserva e desperdiçariam menos energia na forma de calor, em relação as bactérias. Ciliados e bactérias foram isolados do líquido ruminal por filtração e centrifugação, respectivamente. Posteriormente, os ciliados e as bactérias foram suspensos em tampão isento de nitrogênio para limitar o crescimento e dosados com 5 mM de glicose. As amostras foram coletadas ao longo do tempo e, posteriormente, divididas por centrifugação em pellets (células) e sobrenadante. Amostras de pellets foram analisadas quanto à reserva de carboidratos e proteínas, enquanto amostras de sobrenadante foram analisadas para glicose livre, ácido D-L lático, ácido acético, propionato e butirato. Adicionalmente, foi analisado a produção de calor e gases de fermentação (H 2 , CH 4 e CO 2 ). O metabolismo endógeno, a síntese de carboidratos de reserva e o desperdício na forma de calor foram calculados a partir dos dados das análises. A maior parte dos dados foi analisada usando o PROC GLIMMIX do SAS. Teste t de Student foi usado para separar as médias ou determinar se as médias diferiam de 100%. Regressão local (pacote LOCFIT de R; Loader, 1999) foi usada para ajustar os dados das séries no tempo. Em comparação com as bactérias, os ciliados consumiram três vezes mais glicose e sintetizaram carboidratos de reserva quatro vezes mais rápido. Eles incorporaram 53% da glicose em carboidratos de reserva, quase o dobro do valor (27%) obtido para as bactérias. Desperdício de energia na forma de calor não foi detectado para os ciliados, uma vez que toda a produção de calor foi contabilizada pela síntese de reserva de carboidratos e pelo metabolismo endógeno. Em bactérias, a síntese de carboidratos de reserva e o metabolismo endógeno representaram apenas 68% da produção total de calor, assim, elas desperdiçaram grande quantidade de energia por meio da produção de calor (32% da produção total de calor). Esses resultados sugerem que os protozoários ciliados ruminais alteram o curso do metabolismo de carboidratos no rúmen, consumindo glicose mais rapidamente, limitando o uso do excesso de carboidratos pelas bactérias. Essa ação dos ciliados no rúmen provavelmente maximiza a síntese carboidratos de reserva, enquanto minimiza a ocorrência de desperdício de energia na forma de calor.