Caracterização molecular de um vírus com genoma de DNA que infecta Ralstonia solanacearum e caracterização de proteínas H-NS e sua função na regulação do sistema CRISPR-CAS

Abstract

Os vírus que infectam bactérias são os organismos mais abundantes do planeta, e desempenham importantes funções para a manutenção do ecossistema. Nos últimos anos, o uso de vírus como ferramenta de controle biológico tem ganhado bastante atenção, devido, principalmente, à dificuldade de se isolar novas drogas antimicrobianas e à seleção de bactérias resistentes às drogas já existentes. Devido a esse potencial como agentes de controle biológico, as descobertas sobre esses vírus tem aumentado o que amplia as perspectivas do manejo ecológico de doenças em plantas. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos i) caracterizar um bacteriófago isolado de Ralstonia solanacearum proveniente do estado do Ceará, Brasil ii) caracterizar proteínas H-NS de Ralstonia solanacearum e estudar seu o efeito regulatório no sistema CRISPR-Cas. A partir de um isolado não patogênico de Ralstonia solanacearum, foi isolado um vírus filamentoso que possui um ciclo de multiplicação do tipo pseudo-lisogênico. O genoma viral foi completamente sequenciado, possui 6945 nucleotídeos e conteúdo de GC de 61,25%. A organização genômica é típica de vírus da família Inoviridae, gênero Inovirus. Comparação da sequência obtida com sequências de outros Inovirus sugere que o isolado viral é uma nova espécie do grupo φRSM, tentativamente denominada Ralstonia solanacearum Inovirus Brazil 1 (RSIBR1). Partículas de RSIBR1 foram transmitidas para R. pseudosolanacearum, que quando infectadas pelo RSIBR1 também perdeu a capacidade de causar doença em plantas de tomate, sugerindo que a infecção viral interfere com a patogenicidade de Ralstonia spp. Em estudos anteriores, foi demonstrado que o sistema CRISPR-Cas de Ralstonia solanacearum é inativo. Para avaliar se essa inatividade pode ser explicada pela presença de proteínas do tipo H-NS,foi realizada uma busca por genes que codificam H-NS no genoma de Ralstonia solanacearum. Três cópias de H-NS (H-NS 1, 2 e 3) foram localizadas no megaplasmídeo. Não foram identificadas cópias de H-NS codificadas no cromossomo bacteriano. As H-NS de Ralstonia solanacearum possuem os domínios de oligomerização e de ligação a DNA bem conservados. A análise filogenética de proteínas H-NS de diferentes bactérias agruparam de acordo com as famílias Enterobacteriaceae,Pseudomonadaceae e Ralstoniaceae. Além disso, foi observado que as proteínas H-NS da família Ralstoniaceae são altamente conservadas com H-NS codificadas por podovírus, sugerindo que as H-NS de Ralstoniaceae podem ser de origem viral. Foi realizada uma análise in silico nos promotores das proteínas CAS para verificar a presença de sítios de ligação de H-NS. Foram identificadas regiões de alto conteúdo AT, com curvatura típica potencial para a ligação de H-NS. A análise da expressão das H-NS mostrou que somente as H-NS 1 e 3 são expressas em Ralstonia solanacearum. Para confirmar que as proteínas H-NS possuem efeito regulatório na expressão dos genes Cas, foram construídos cassetes para a obtenção de mutantes para H-NS1, H-NS 2 e H-NS3. A obtenção dos mutantes e a análise da expressão dos genes Cas nos mutantes irão permitir elucidar o papel regulatório de H-NS na expressão do sistema CRISPR-Cas em Ralstonia solanacearum.

Viruses that infect bacteria are the most abundant organisms on the planet, and play important roles in maintaining the ecosystem. In recent years, the use of viruses as a biological control tool has gained a lot of attention, mainly due to the difficulty of isolating new antimicrobial drugs and the selection of bacteria resistant to existing drugs. Because of this potential as biological control agents, the findings on these viruses have increased what broadens the perspectives of the ecological management of diseases in plants. In this context, the present work had as objectives i) to characterize a bacteriophage isolated from Ralstonia solanacearum from the state of Ceará, Brazil ii) to characterize H-NS proteins of Rastonia solanacearum and to study its regulatory effect in the CRISPR-Cas system. From a non-pathogenic isolate of Ralstonia solanacearum, a filamentous virus was isolated which has a pseudo-lysogenic- like multiplication cycle. The viral genome was completely sequenced, containing 6945 nucleotides and a GC content of 61.25%. The genomic organization is typical of viruses of the family Inoviridae, genus Inovirus. Comparison of the sequences obtained with other inovirus sequences suggests that the viral isolate is a new species of the φRSS group, tentatively named Ralstonia solanacearum Inovirus Brazil 1 (RSIBR1). RSIBR1 particles were transmitted to R. pseudosolanacearum, which when infected by RSIBR1 also lost the ability to cause disease in tomato plants, suggesting that the viral infection interferes with the pathogenicity of Ralstonia spp. In previous studies, it has been shown that the CRISP-Cas system of Ralstonia solanacearum is inactive. To assess whether this inactivity can be explained by the presence of H-NS type proteins, we searched for genes encoding H-NS in the Ralstonia solanacearum genome. Three H-NS copies (H-NS 1, 2 and 3) were located in megaplasmid. No copies of H-NS encoded on the bacterial chromosome were Identified. Ralstonia solanacearum H-NS have the well-conserved oligomerization and DNA binding domains. Phylogenetic analysis of H-NS proteins from different bacteria grouped according to the families Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae and Ralstoniaceae. In addition, it was observed that the H-NS proteins of the Ralstoniaceae family are highly conserved with H-NS encoded by podovirus, suggesting that the H-NS of Ralstoniaceae may be of viral origin. An in silico analysis was performed on the promoters of the CAS proteins to verify the presence of H-NS binding sites. Regions with high AT content were identified, with a typical potential curvature for H-NS binding. Analysis of H-NS expression showed that only H-NS 1 and 3 are expressed in Ralstonia solanacearum. To confirm that H-NS proteins have a regulatory effect on the expression of Cas genes, cassettes were constructed to obtain mutants for H-NS1, H-NS2 and H-NS3. Obtaining the mutants and analyzing the expression of the Cas genes in the mutants will enable elucidating the regulatory role of H-NS in the expression of the CRISPR-Cas system in Ralstonia solanacearum.