Clonagem e caracterização dos genes que codificam endo-xilogalacturonana hidrolase, o fator de transcrição PacC e a proteína PalA em Crinipellis perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa em Theobroma cacao

Abstract

Crinipellis perniciosa é o agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro, e em outras espécies do gênero Theobroma, causando danos na cultura do cacau e cupuaçu com grande impacto econômico. Neste trabalho, descrevem-se o isolamento e a caracterização dos genes que codificam endoxilogalacturonana hidrolase (Xgh), PalA e PacC. O gene xghCp possui uma região codificadora de 1.251 pares de bases, interrompida por quatro possíveis íntrons. A proteína deduzida apresenta 417 aminoácidos, sendo codificada por um gene cópia única. A transcrição do gene foi analisada por meio da técnica de RT-PCR, sendo avaliados os efeitos do pH e das fontes de carbono glicose e pectina. A transcrição do gene não foi reprimida por glicose 1%. Em presença de pectina os transcritos do gene xghCp foram detectados em pHs variando de 4,0 a 8,0. Na análise filogenética da proteína deduzida, XghCp agrupou-se com endo-xilogalacturonana hidrolase de Aspergillus tubingensis, Aspergillus niger e duas enzimas similares a Xgh de Aspergillus fumigatus. O alinhamento múltiplo revelou que XghCp apresenta, na região correspondente ao sítio de ligação ao substrato de poligalacturonase, a seqüência GIK (Gy-Ile-Lys) que foi comum a todas as endo-xilogalacturonanas hidrolase analisadas. Este é o primeiro relato de endo-xilogalacturonana hidrolase em basidiomiceto. Neste trabalho também foi realizada a clonagem e caracterização dos genes palA e pacC, relacionados à transdução de sinal em resposta ao pH em C. perniciosa. A transcrição do gene palACp não é regulada por pH e a proteína deduzida apresentou o domínio conservado BRO1. A análise filogenética mostrou que esta proteína é conservada de fungos a humanos. Foram seqüenciados 4.347 pb correspondentes ao gene pacCCp, que apresentou uma ORF de 2.472 pb interrompida por 8 íntrons putativos. Na região promotora, foram localizados três possíveis sítios de reconhecimento para PacCCp (5 GCCAG3 ), o que sugere um sistema de auto-indução deste gene em pH alcalino. Os transcritos do gene pacCCp foram detectados por RT-PCR em pH 6,8 e 8,0 em 8, 18 e 32 horas após a indução. Em pH 4,0, foi observada a transcrição basal no período de 8 a 32 horas. A seqüência deduzida apresentou 824 aminoácidos, com domínios dedos de zinco extremamente conservados em leveduras e fungos filamentosos. Motivos de reconhecimento proteína-proteína YPXL/I de interação com PalA foram localizados na região C-terminal da proteína PacCCp entre os aminoácidos 637 e 742. A identificação dos genes pacC e palA sugere que C. perniciosa, apresenta a cascata de sinalização em resposta ao pH.

Crinipellis perniciosa is the causal agent of witches broom disease in cocoa plants as well as in other species of Theobroma, with important economic impact in both cocoa and cupuaçu crops. We report the isolation and characterization of the genes encoding endo-xylogalacturonan hydrolase (Xgh), PalA and PacC. The xghCp gene contains a 1,251 base pairs coding region interrupted by four putative introns. The deduced protein displays 417 amino acid residues and is coded by a single-copy gene (xghCp). Gene transcription has been analyzed by semi-quantitative RT-PCR, and the effects of either pH or the carbon sources glucose and citric pectin have been evaluated. Gene transcription was not repressed by 1% glucose. In the presence of pectin, xghC transcripts were detected from pH 4,0 to pH 8,0. Phylogenetic analysis of the deduced protein, XghCp, grouped it with endo- xylogalacturonan hydrolase of both Aspergillus tubingensis and Aspergillus niger, as well as with two Xgh similar enzymes of Aspergillus fumigatus. Multiple alignment revealed that XghCp presents a GIK sequence (Gly-lle-Lys), common to all endoxylogalacturonan known hydrolases, in the region corresponding to the polygalacturonase substrate binding site. This is the first report of an endoxylogalacturonan hydrolase in a basidiomycete. Cloning and characterization of palA and pacC, both related to signal transduction in response to pH in C. perniciosa, were also achieved. palACp transcription was not regulated by pH, and the deduced protein showed a conserved BRO1 domain. The phylogenetic analysis showed it to be a widely conserved protein, from fungi to human beings. A total of 4,347 bp corresponding to pacCCp, which displayed an ORF containing 2,472 bp interrupted by 8 putative introns, has been sequenced. Three possible sites of PacC cis-elements (5 GCCAG3 ) have been localized in the promoter region, suggesting a self-induction system for this gene under alkaline pH. Transcripts of pacCCp were detected by RT-PCR at pH 6.8 and pH 8.0 at 8, 18, and 32 hours after induction. At pH 4.0, basal transcription was observed from 8 to 32 hours. The deduced sequence exhibited 824 amino acid residues with zinc fingers domains highly conserved in yeasts and filamentous fungi. YPXL/l protein-protein recognition motifs, which interact with PalA, were localized in the C-terminal region of PacCCp between amino acid residues 637 and 742. pacC and palA identification suggests that C. perniciosa presents a signaling cascade in response to pH, which would allow PacCCp transcription factor to act as a regulator of environmental pH controlled virulence factors