Análise da expressão de genes envolvidos com a resposta de defesa do feijoeiro comum à ferrugem

Abstract

A ferrugem do feijoeiro é uma doença que, no Brasil, causa sérios prejuízos à cultura do feijão, uma leguminosa de grande importância sócio - econômica, e pouco se sabe sobre a interação feijoeiro-Uromyces appendiculatus, fungo causador da ferrugem. No presente trabalho, utilizando- se linhagens de feijão quase isogênicas, resistente e suscetível à ferrugem, foram clonados fragmentos RT-PCR de cDNA homólogos a genes que codificam proteínas envolvidas com a resposta de defesa na planta. Esses clones denominados PvPR2 e PvPR3 (proteínas relacionadas à patogênese 2 e 3), CHI (quitinase), GLU (glucanase), CHS (chalcona sintase), PAL (fenilalanina amônia-liase) e LOX (lipoxigenase), foram seqüenciados e utilizados como sondas em análises de expressão temporal. As cinéticas de expressão de três proteínas relacionadas à patogênese, PvPR2, quitinase e glucanase, foram analisadas durante a infecção por U. appendiculatus pela técnica de Northern Blot. A hibridização com a sonda PvPR2 apresentou expressão diferencial entre os indivíduos resistentes e suscetíveis, sendo que nos indivíduos resistentes a indução do gene para PvPR2 ocorreu mais rapidamente do que nos indivíduos suscetíveis e em maior intensidade, sendo a diferença detectada de um intervalo de 6 h. Em muitos casos a diferença principal entre interações resistente e suscetível é a rapidez, e não a extensão, da expressão de genes envolvidos com a resposta de defesa. A hibridização com a sonda CHI demonstrou que nos indivíduos resistentes a sua expressão também iniciou-se mais cedo em relação aos indivíduos suscetíveis, como ocorreu com a sonda PvPR2, porém as maiores diferenças ocorreram com um intervalo de 24 h. A sonda GLU mostrou-se homóloga a uma endoglucanase básica, uma proteína intracelular. O resultado da hibridização sugere que não há uma expressão diferencial entre os indivíduos resistentes e suscetíveis, indicando que, provavelmente, o gene que codifica essa proteína é induzido por U. appendiculatus , mas a enzima não atua no processo de restrição de crescimento do fungo. Todas os cDNAs isolados neste trabalho poderão ser utilizados como sondas em bibliotecas genômicas e de cDNA para se obter os respectivos genes e cDNAs completos. Uma vez caracterizados, esses genes poderão ser utilizados em diversos estudos, inclusive em experimentos de transformação de plantas visando o aumento de tolerância a patógenos por super-expressão de um gene sabidamente envolvido com o processo de defesa.

Bean rust is a disease which causes great losses to bean cultures, a leguminous species of great social-economic importance in Brazil. Little is known about the bean-Uromyces appendiculatus interaction, the latter being the rust causing fungus. In this work, RT-PCR fragments were amplified from cDNAs which were homologous to genes that encode proteins related to defense response in bean, using near isogenic lines, resistant and susceptible to rust. These probes were sequenced and named PvPR2 and PvPR3 (pathogenesis -related proteins 2 e 3), CHI (chitinase), GLU (glucanase), CHS (chalcone synthase), PAL (phenylalanine ammonia -lyase) e LOX (lipoxygenase). The expression kinetics of three pathogenesis-related proteins, PvPR2, chitinase and glucanase, during infection was analyzed by Northern blot. Hybridization with the PvPR2 probe showed differential expression between resistant and susceptible individuals. In resistant individuals induction of the PvPR2 gene was faster and more intense than in susceptible individuals, with the difference being detected in a 6-hour period. In many cases, the main difference between resistant and susceptible interactions was in the timing, and not extension of gene expression related to defense response. The Northern blot result for the chitinase probe showed an early expression of the chitinase gene in resistant individuals compared to susceptible ones. That was also the case of the PvPR2 probe, however, in that case the time difference was of 24 hours. This difference is probably the reason for the successful defense mechanism which limits pathogen growth in resistant individuals. The glucanase probe was homologous to an intracellular protein, endoglucanase. The Northern blot result showed no differential expression between resistant and susceptible individuals, indicating that the endoglucanase gene might be induced by infection with U. appendiculatus but the endoglucanase enzyme will not act in restricting the pathogen. All probes isolated in this work can be used for probing genomic and cDNA libraries to obtain complete genes and cDNAs of interest. Once characterized, these genes will be useful in several studies, such as the increase in pathogen tolerance in transgenic plants showing overexpression of a gene induced during the plant defense response.