Clonagem e caracterização de homólogos do gene Sw-5 amplificados do acesso LA 371 de Lycopersicon peruvianum (L.) Mill

Abstract

O gene Sw-5, membro de uma família multigênica com membros dispersos nos cromossomos 9 e 12 do tomateiro, é o principal gene de resistência a tospovírus utilizado nos programas de melhoramento de tomateiro para a indústria e para mesa. O acesso LA 371 de Lycopersicon peruvianum possui resistência de amplo espectro a tospovírus e estudos de introgressão e análise genética da resistência demonstraram que a resistência desse acesso é determinada por um gene dominante localizado no loco Sw-5 ou em um loco proximamente ligado. Estudos prévios haviam levantado a hipótese de que oligonucleotídeos que anelam nas regiões correspondentes ao início da ORF codificada por Sw-5 e na região 5’ deste gene poderiam amplificar seqüências do loco Sw-5 e de um loco proximamente ligado. Esta hipótese foi confirmada neste trabalho. Utilizando esses oligonucleotídeos foram amplificados e clonados dois genes homólogos ao Sw-5, denominados de homólogo 1 e homólogo 2, a partir de DNA extraído de uma planta resistente a tospovírus denominada EP-1 derivada do acesso LA 371. As proteínas putativas codificadas por esses homólogos apresentam 92,94 % de similaridade diferindo em 82 aminoácidos. A proteína 2 é mais similar à proteína codificada pelo gene Sw-5 (99,28%) sugerindo que o homólogo 2 é responsável pela resistência a tospovírus encontrada em LA 371. Essas seqüências foram transferidas para o vetor binário pBI121 e experimentos de transformação encontram-se em andamento visando à comprovação da função desses homólogos na resistência de LA 371 a tospovírus.

The gene Sw-5, member of a multigenic family with members dispersed in tomato chromosomes 9 and 12, is the most used tospovirus resistance gene in tomato breeding programs. The Lycopersicon peruvianum accession LA 371 has a broad-spectrum toposvirus resistance. Genetic analysis has demonstrated that a dominant gene located in the Sw-5 locus or in a closely linked locus is responsible for tospovirus resistance of this accession. Prior studies suggested that oligonucleotides with complementary sequences corresponding to the terminal regions of the Sw-5 ORF would be able to amplify sequences from the Sw-5 locus and from one closely linked locus. This hypothesis was confirmed in this work. DNA extracted from a tospovirus resistant plant called EP-1, derived from the accession LA 371, was used as template for PCR amplification. The PCR product was cloned and restriction analysis revealed that two Sw-5 homologous sequences, called homologous 1 and homologous 2, had been cloned. The putative protein codified by these homologous display 92.94% of similarity for each other, differing in 82 amino acids. The protein coded by homologous 2 is more similar to Sw-5 protein (99.28%) suggesting that this homologous is responsible for the LA 371 tospovirus resistance. These sequences were transferred to the binary vector pBI121 and transformation experiments are in progress aiming to test this hypothesis.