Extração enzimática de fêmeas de Meloidogyne spp. de raízes e seus efeitos na identificação de espécies por eletroforese de isoenzimas e sobre Pasteuria penetrans

Abstract

Extratos enzimáticos de diferentes fungos foram avaliados quanto à maceração de raízes, a fim de se extrair mais fácil e rapidamente fêmeas de Meloidogyne spp. para estudos de controle biológico e para a identificação de espécies por eletroforese de isoenzimas. Raízes de tomateiro infectadas por Meloidogyne javanica foram imersas em extrato enzimático produzidas pelos fungos Aspergillus niger, Penicillium griseoroseum ou Penicillium italicum, separadamente ou em mistura de 50% de enzimas de cada fungo, em combinações de dois a dois, ou em tampão fosfato (testemunha), e incubadas a 30oC/24h. As enzimas produzidas pelo fungo P. griseoroseum foram as mais eficientes na degradação da parede das células das raízes de tomateiro, equiparando-se às enzimas comerciais importadas, pectinase + celulase (Clarex, Miles do Brasil - 15.000 ajdv/g; Sigma Chemical Ltda- 5.000 un.), utilizadas para a extração de fêmeas de Meloidogyne spp. Raízes com galhas parasitadas com as espécies M. incognita, M. javanica ou M. arenaria foram imersas em tampão de acetato de sódio apenas ou com enzimas liofilizadas de P. griseoroseum, em diferentes concentrações, e incubadas a 40°C/24h. A atividade de 200 U/mL proporcionou maior liberação de fêmeas, e essas foram submetidas à eletroforese de isoenzimas. Não foram observadas bandas, em gel de poliacrilamida, de fêmeas retiradas pela incubação em enzimas fúngicas, mas bandas foram vistas quando as fêmeas foram retiradas manualmente. Para avaliar o efeito das enzimas na adesão de endósporos aos juvenis de M. javanica, fêmeas foram retiradas manualmente e por maceração enzimática a 200 U/mL. Os endósporos de fêmeas extraídas por digestão enzimática apresentaram maior adesão a J2 de M. javanica em relação à testemunha. A reprodução dos endósporos de P. penetrans em fêmeas de M. javanica não foi afetada pela enzima. Para melhorar a quantificação de endósporos de P. penetrans em pó de raiz utilizado como inóculo para aplicação da bactéria no campo, as enzimas a 2% e 20% foram adicionadas a 2g do pó de raiz com P. penetrans e incubados a 40°C. O extrato enzimático na concentração de 20%, independente do tempo de incubação, possibilitou observar maior número de endósporos. O uso de enzimas fúngicas para a extração de fêmeas de Meloidogyne spp., demonstrou ser bastante eficiente e vantajoso, sem prejudicar a adesão e multiplicação de P. penetrans no nematóide; porém, não é recomendada para a identificação de M. javanica, M. incognita e M. arenaria por eletroforese de isoenzimas.

Enzymatic extracts from different fungi were evaluated for root maceration as an easier and faster way of extracting Meloidogyne spp. females from roots, to be used in biological control studies and in species identification by isozyme electrophoresis. Tomato roots infected by M. javanica were immersed in enzymatic extracts produced by Aspergillus niger, Penicillium griseoroseum or P. italicum, separately or in mixtures of 50% of enzymatic extracts of each fungus, two by two, or in phosphate buffer (control), and incubated at 30oC/24h. The enzymes produced by the fungus P. griseoroseum were the most efficient in the degradation of the tomato root cell walls, being comparable to the imported commercial enzymes pectinase + celulase (Clarex, Miles do Brasil - 15.000 ajdv/g; Sigma Chemical Ltda- 5.000 un.) used for Meloidogyne spp. females extraction. Galled roots parasitized by M. incognita, M. javanica or M. arenaria were immersed in sodium acetate buffer alone or with lyophilized enzymes of P. griseoroseum in different concentrations and incubated at 40°C/24h. The number of 200 U/mL of enzyme preparation provided the best female release, and the females attained using this concentration were subjected to isozyme electrophoresis analysis. No bands could be seen from the females extracted by incubation in fungal enzymes, in the poliacrilamide gel, but typic bands formed from females extracted manually. In order to evaluate the effect of enzymatic extraction on the attachment of endospores on second-stage juveniles (J2) of M. javanica, nematode females parasitized with Pasteuria penetrans were extracted from the roots manually or by maceration in enzyme extract at 200 U/mL. The endospores from females extracted by enzimatic digestion attached in higher number to the M. javanica J2 when compared to the control treatment. The endospore production in M. javanica females was not affected by the enzymes. To improve the endospore counting in root powder used as carrier for field applications, the enzymes at 2% and 20% were added to 2g of root powder containing P. penetrans endospores, and incubated at 40 °C. The enzyme extract at 20%, independent of the incubation time, allowed to observe a higher number of endospores. The use of fungal enzymes to extract Meloidogyne spp. showed to be very efficient and advantageous, without disturbing attachment or reproduction of P. penetrans in the nematode, however, it is not recommended for the identification of M. javanica, M. incognita nor M. arenaria by isozyme electrophoresis.