Utilização de bacteriófagos no biocontrole de Salmonella sp

Abstract

A elevação da produção e comercialização de alimentos é acompanhada pelo aumento das infecções, hospitalizações e mortes relacionadas ao consumo de alimentos contaminados. Entre os alimentos relacionados a infecções alimentares, podemos destacar a carne suína e os ovos, como os principais responsáveis pelos casos de infecções alimentares, e o principal patógeno envolvido no consumo destes alimentos no mundo, são Salmonella Enteritidis em ovos e Salmonella Typhimurium em carne suína. O uso indiscriminado de antimicrobianos na produção animal promoveu diversos mecanismos de resistência em Salmonella, dificultando o controle e a eliminação deste patógeno. Desta forma, ha uma necessidade de desenvolvimento de novas práticas terapêuticas e os bacteriófagos ressurgem como uma alternativa de controle. O objetivo deste trabalho foi isolar e avaliar a atividade de bacteriófagos contra Salmonella Typhimurium e/ou Salmonella Enteritidis em poedeiras, ovos, suínos e na carne suína. No primeiro capítulo é apresentado a utilização de bacteriófagos em poedeiras e nas superfícies de ovos para a avaliação de seu efeito como método de controle de Salmonella Enteritidis. Foram realizados 2 experimentos distintos. O primeiro experimento avaliou o efeito de bacteriófagos livres e microencapsulados em ovos (clara, gema e casca) de galinhas poedeiras contaminadas com Salmonella Enteritidis. Foram utilizadas 50 poedeiras, distribuídas em 5 tratamentos, sendo T1 - Controle positivo - Aves contaminadas com Salmonella Enteritidis (ACSE); T2 - ACSE e inoculadas com bacteriófagos livres (BL); T3 - ACSE e inoculadas com bacteriófagos microencapsulados (BM); T4 - Não CSE e inoculadas com BL; T5 - Não CSE e inoculadas com BM. As aves do T1, T2 e T3 foram contaminadas oralmente pela ingestão de 1 mL de Salmonella Enteritidis (~1O6UFC-mL-1) enquanto os tratamentos T4 e T5 receberam apenas 1 mL de solução tampão PBS esterilizado. Seis horas apos a inoculação do patógeno, e em todo período experimental, as aves do T2 e T4 receberam 1 mL da suspensão de bacteriófagos (~1O9 UFP-mL-1), enquanto as aves dos tratamentos T3 e T5 receberam 1 mL da suspensão de bacteriófagos micro encapsulados (~1O9 UFP-mL-1). A aves tratadas com bacteriófagos livres apresentaram menor detecção do patógeno na superfície da casca, sugerindo que possa ter ocorrido redução da contaminação pelo patógeno. Foi possível isolar bacteriófagos na casca de todas os tratamentos em que ele foi utilizado. Além disso, também foi possível seu isolamento na clara dos ovos do T2. A utilização de bacteriófagos não eliminou o patógeno, mas reduziu o número de amostras positivas ao longo do tempo. O experimento dois avaliou diferentes metodologias de higienização de ovos em relação a presença de Salmonella Enteritidis em diferentes temperaturas e intervalos de tempo. Os ovos (n =720) foram separados em 8 grupos contendo trés diferentes combinações de tratamentos, com 90 ovos cada, sendo os tratamentos: higienizado (H), não higienizado (H), pasteurizado (P), não pasteurizado (P), com bacteriófagos (B), e sem bacteriófagos B), sendo representados por T1 (HPB), T2 (HPB), T3 (HPB), T4 (HP B), T5 (HPB), T6 (HPB), T7 (HPB), T8 (HPB). Os tratamentos foram incubados a 4 0C, 7 0C e 24 0C e analisados nos intervalos de 1, 3, 7, 14 e 28 dias. A presença do patógeno foi observada em todas as amostras de casca incubada em todas as temperaturas e intervalos de tempos. Entretanto sua detecção na clara e na gema não foi possível quando os ovos foram incubados a 4 0C. Os tratamentos higienizados (T5 (HPB), T6 (HPB), T7 (HPB) e T8 (HPB)) apresentaram os maiores valores (p < 0,05) em relação aos outros tratamentos ao longo do tempo nas diferentes temperaturas. Além disso, o tratamento T2 (HPB) obteve, os menores valores médios de crescimentos (log UFC-mL-1) do patógeno em todas as temperaturas e amostras analisadas (p < 0,05). Estes resultados sugerem que a higienização e a pasteurização dos ovos podem contribuir para a contaminação e penetração do patógeno ao longo do tempo, mesmo em baixas temperaturas. Além disso, a utilização de bacteriófagos resultou em uma contagem media (log UFC-mL-1) do patógeno inferior na maioria dos tratamentos em que foi utilizado. O capitulo dois apresenta o isolamento de bacteriófagos específicos para as duas principais estirpes de Salmonela e sua utilização no controle do patógeno em ovos líquidos e em carne suína moída. Os ovos líquidos e a carne moída suína foram contaminados com os patógenos, incubados a 4 0C e a 24 0C e as amostras analisadas quanto a redução do patógeno em diferentes intervalos de tempos (1 dia, 7 dias e 14 dias. A Multiplicidade de Infecções(MOI) utilizada em todos os tratamentos foi de 1x 101 UFP/UFC. Foi possível observar redução significativa (p < 0,05) da concentração dos patógenos em todos os tratamentos realizados a 24 0C. A 4 0C o bacteriófago foi capaz de reduzir (p < 0,05) a concentração de Salmonella Typhimurium em um dia e uma semana de incubação na carne suína moída e no ovo líquidos. Entretanto, só foi possível observar a redução (p < 0,05) de Salmonella Enteritidis nas amostras de carne suína moída incubadas por 1 dia e 1 semana a 40C. Após duas semanas de incubação a 40C não houve redução significativa (p >0,05) dos patógenos em nenhum dos alimentos avaliados. Os maiores índices de redução ocorreram a 40C quando Salmonella Typhimurium foi o hospedeiro, sendo de 1,65 log10 UFC-g-1 em carne suína moída e 3,14 l log10 UFC- g-1 em ovos líquidos. Concluiu-se que o bacteriófago foi capaz de reduzir a contaminação de Salmonella Typhimurium em ambos alimentos, entretanto seu efeito foi não significativo para o controle de Salmonella Enteritidis em ovos líquidos. O terceiro capitulo teve como objetivo avaliar o efeito causado pelos bacteriófagos no trato gastrointestinal de suínos em relação ao efeito causado pelos antibióticos utilizados como melhoradores de desempenho. Dezoito suínos utilizados para o experimento foram divididos em três tratamentos: Tratamento controle (TC), tratamento com antibióticos (TA) e tratamento com bacteriófagos (TB). A ração dos suínos do TA foi suplementada com AUREO S-P 250®. Os animais do TB receberam diariamente, via oral, 5 mL do coquetel contendo 1,0 x 1010 UFP-mL-1 de bacteriófagos e os suínos do TC receberam apenas a ração basal. Após os 21 dias de tratamento os animais foram novamente pesados e abatidos, e o conteúdo fecal do ileo, ceco e colón foram coletados para a realização das análises. Para avaliar a diversidade de bactérias no colón, ileo e ceco, a região V3 do gene 16S rRNA do DNA metagenômico foi amplificada pela reação da polimerase em cadeia (PCR), usando os primers 338F e 518R e analisada pela DGGE. Analisando o dendograma foi possível observar que a maioria das amostras do ceco e do colón se agruparam de forma heterogênea. Estes agrupamentos apresentaram diferença significativa (p < 0,01) na composição microbiana presentes em cada amostra. Mesmo os efeitos dos tratamentos não terem se agrupado de forma homogênea no dendograma, os padrões de amplicons das amostras mostrou efeito significativo (p < 0,10) somente na comparação entre o TA e o TC, enquanto para as outras comparações (TB x TC e TB x TA) os efeitos não foram significativos (p > 0,05). Este resultado sugere uma pequena mudança na composição da microbiota dos animais do TB, apesar do resultado não ter sido estatisticamente significativo.

The increase in production and marketing of food is accompanied by an increase in infections, hospitalizations, and deaths related to the consumption of contaminated food. Among the foods related to food infections, we can highlight the pork and eggs as the main responsible for cases of foodborne illness, and the main pathogen involved in the consumption of these foods in the world, are Salmonella Enteritidis in eggs and Salmonella Typhimurium in pork. The indiscriminate use of antimicrobials in animal production promoted several mechanisms of resistance in Salmonella, making it difficult to control and elimination of this pathogen. Thus, there is a need to develop new therapeutic approaches and bacteriophages reappeared as a control alternative. The objective of this study was to isolate and evaluate the bacteriophage activity against Salmonella Typhimurium and / or Salmonella Enteritidis in laying, eggs, pigs and pork. In the first chapter is presented the use of bacteriophages in layers and the surfaces of eggs for the evaluation of its effect as Salmonella Enteritidis control method. Two separate experiments were performed. The first experiment assessed the effect of free and microencapsulated bacteriophage eggs (clear, yolk and shell) laying hens infected with Salmonella Enteritidis. 50 laying hens were distributed in five treatments: T1 - Positive Control - Poultry contaminated with Salmonella Enteritidis (ACSE); T2 - ACSE and inoculated with free bacteriophages (BL); T3 - ACSE and inoculated with microencapsulated bacteriophage (BM); T4 - Not CSE and inoculated with BL; T5 - Not CSE and inoculated with BM. The birds T1, T2 and T3 were infected orally by ingestion of Salmonella enteritidis 1 mL (~ 106 CFU-ml-1) while T4 and T5 treatments only received 1 ml of PBS sterile buffer. Six hours after inoculation of the pathogen, and throughout the experimental period the birds T2 and T4 received 1 ml of suspension of bacteriophages (~1O9 PFU-ml-1), while birds T3 and T5 treatments received 1 ml of suspension micro encapsulated bacteriophages (~ 106 PFU-ml-1). The birds treated with free bacteriophages showed lower detection of the pathogen in the shell surface, suggesting that may have occurred reduction of contamination by the pathogen. It was possible to isolate bacteriophage hulls of all treatments in which it was used. Furthermore, it was also possible in isolation of clear eggs T2. The use of bacteriophages did not eliminate the pathogen, but reduced the number of positive samples over time. The second experiment evaluated different eggs sanitization methods for the presence of Salmonella Enteritidis at different temperatures and time intervals. The eggs (n = 720) were separated into 8 groups containing three different combinations of treatments with 90 eggs each, the treatments being: sanitized (H) not sanitized (H), pasteurized (P), non-pasteurized (P), with bacteriophage (B) and without bacteriophages (B), being represented by T1 (HPB), T2 (HPB), T3 (HPB), T4 (HP B), T5 (HPB), T6 (HPB), T7 (HPB), T8 (HPB). The treatments were incubated at 4 ° C, 7 ° C and 24 ° C and analyzed at intervals of 1, 3, 7, 14 and 28 days. The pathogen was observed in all the samples incubated peel at all temperatures and time intervals. But its detection in the clear and the yolk was not possible when the eggs were incubated at 4 ° C. The sanitized treatments (T5 (HPB), T6 (HPB), T7 (HPB), and T8 (HPB)) showed the highest values (p < 0.05) compared to other treatments over time at different temperatures. Furthermore, the treatment T2 (HPB), gave the smallest average values of growth (log CFU-ml-1) pathogen at all temperatures and the samples analyzed (p < 0.05). These results suggest that the cleaning and pasteurization of eggs can contribute to contamination and pathogen penetration over time, even at low temperatures. Furthermore, the use of bacteriophages resulted in an average count (log CFU-ml-1) pathogen in the lower most treatments that was used. The chapter two presents the isolation of bacteriophages specific to the two main strains of Salmonella and their use in pathogen control in liquid egg and ground pork. Liquid egg and pork ground beef were contaminated with pathogens, incubated at 4 °C and 24 °C and the samples analyzed for the reduction of the pathogen in different time intervals (1 day, 7 days and 14 days. Multiplicity of Infection (MOI) used in all treatments was 1 x 101 PFU/CFU. it was observed a significant reduction (p < 0.05) the concentration of pathogens in all treatments carried out at 24 ° C. the bacteriophage 4 ° C was able to reduce (p < 0.05) the concentration of Salmonella typhimurium in a day and a week of incubation in the ground pork and egg liquids. However, it was only possible to observe a reduction (p < 0.05) in Salmonella Enteritidis samples minced pork incubated for 1 day and 1 week at 4 ° C. After two weeks of inoculation at 4 ° C showed no significant reduction (p > 0.05) of the pathogens in any of the evaluated food. the largest reduction ratios occurred at 4 ° C when Salmonella Typhimurium has been the host, and 1.65 log10 CFU-g-1 in ground pork and 3.14 log10 CFU-g-1 for liquid eggs. It was concluded that the bacteriophage is capable of reducing contamination of Salmonella Typhimurium in both foods, though its effect was not significant to control Salmonella Enteritidis in liquid eggs. The third chapter aimed to evaluate the effect caused by the bacteriophages in the gastrointestinal tract of pigs in relation to the effect caused by the antibiotics used as performance enhancers. Eighteen pigs used for the experiment were divided into three treatments: control treatment (TC) treatment with antibiotics (TA) and treated with bacteriophage (TB). The ration of the TA pigs was supplemented with AUREO S-P 250®. The animals received daily TB orally 5 ml cocktail containing 1.0 x 1010 PFU-ml -1 bacteriophages and TC pigs received only the basal ration. After 21 days of treatment the animals were weighed again and killed, and the faecal contents of the ileum, cecum and colon were collected for the analyzes. To evaluate the diversity of bacteria in the colon, ileum and cecum, the gene 168 rBNA V3 region of metagenomic DNA was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using primers 338F and 518R and analyzed by DGGE. Analyzing the dendrogram was observed that most of the samples of the cecum and colon were grouped heterogeneously. These groups showed significant differences (p < 0.01) in the microbial composition present in each sample. Even the effects of treatments have not been grouped homogeneously in the dendrogram, amplicon patterns of the samples showed significant effect (p 0.10) only in the comparison between TA and TC, while other comparisons (TB x CT x TA and TB) the effects were not significant (p > 0.05). This result suggests a slight change in the composition of the microbiota of animals of TB, despite the result was not statistically significant.