Desenvolvimento e avaliação da imunogenicidade de uma vacina de DNA tetravalente combinada com adjuvantes genéticos contra os vírus dengue

Abstract

A dengue é a mais importante arbovirose que afeta o homem e o aumento crescente de casos nas áreas endêmicas bem como a possível expansão da área de risco de infecção tem causado preocupação em todo o mundo. Atualmente, as medidas de controle da doença são baseadas no controle do vetor, mosquitos do gênero Aedes sendo que estas não se mostraram eficientes, uma vez que o número de infecções aumentaram cerca de 30 vezes nos últimos 50 anos. Os vírus dengue possuem quatro sorotipos DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4 e uma infecção com um sorotipo promove imunidade protetora contra infecções com o mesmo sorotipo. Numa segunda infecção com um sorotipo heterólogo, os anticorpos não-neutralizantes produzidos na primeira infecção podem aumentar o número de células infectadas e assim, exacerbar a resposta imune. Esse fenômeno, conhecido por ADE (antibody dependent enhancement) está relacionado com as formas graves da doença e por essa razão, uma vacina eficiente contra dengue deve ser tetravalente. Este trabalho tem o objetivo de construir uma vacina de DNA tetravalente contra a dengue e, adicionalmente desenvolver adjuvantes genéticos para aprimorar a imunogenicidade dessa vacina. Para isso, as sequências de DNA correspondentes ao domínio III da proteína E dos quatro sorotipos dos vírus da dengue foram clonadas num mesmo vetor de expressão. Para o desenvolvimento de adjuvantes genéticos, genes das citocinas GM-CSF, IL-7 e IL-15 foram clonados separadamente em plasmídeo de expressão de modo que diferentes associações dos adjuvantes genéticos pudessem ser avaliadas com o plasmídeo vacinal. A avaliação da imunogenicidade da vacina de DNA tetravalente e sua associação com os diferentes adjuvantes mostrou que houve uma resposta linfoproliferativa contra as proteínas prM e E recombinantes de DENV-3, sendo os esplenócitos oriundos dos grupos que receberam pVAX-EDIII1-4 e pVAX-IL15, pVAX-EDIII1-4 e pVAX-GMCSF e pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX-IL7 apresentaram maior resposta quando re-estimulados in vitro. Também foi observado um aumento no número de células B nos grupos vacinados com pVAX-EDIII1-4 e pVAX-GMCSF e pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX- IL15. Na subpopulação de células T CD4 houve incremento no grupo imunizado com pVAX-EDIII1-4 e GMCSF e as células T CD8, no grupo imunizado com pVAX- EDIII1-4 e pVAX-IL7. Observou-se um aumento na subpopulação de linfócitos T CD8 CD44+ CD62L- (TEM-memória efetora) nos grupos imunizados com pVAX-EDIII1-4 e pVAX-IL7 e pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX-IL7. Em relação à memória central (TCM - CD44+ CD62L+) T CD4 e T CD8 o maior aumento se deu no grupo imunizado com pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX-IL15. As células naïve T CD4 e T CD8 também estão aumentadas no grupo imunizado com pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX-IL15. No ensaio de neutralização in vivo com DENV-2, observou-se 60% de proteção nos animais que tiveram o vírus neutralizado com o soro dos animais vacinados com o pVAX-EDIII1-4 e pVAX-IL7; 40% de proteção nos animais que tiveram o vírus neutralizado pelo soro dos animais vacinados com o pVAX- EDIII1-4; pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX-IL7; pVAX-EDIII1-4, pVAX- GMCSF e pVAX-IL15. No mesmo ensaio utilizando DENV-1, podemos observar que o grupo cujo vírus foi neutralizado com o soro dos animais vacinados com pVAX-EDIII1- 4 e pVAX-IL7 a sobrevivência foi de 80% e de 60% nos grupos que receberam o vírus neutralizado com o soro dos animais vacinados com apenas o pVAX-EDIII1-4, pVAX- EDIII1-4 e pVAX-GMCSF, pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX-IL7 e pVAX- EDIII1-4, pVAX-GMCSF e pVAX-IL15. Esses resultados mostram que a vacina foi capaz de induzir uma resposta imune e que os adjuvantes testados auxiliaram essa resposta.

Dengue is the most important arboviral disease that affects humans and the increasing number of cases in endemic areas and the possible expansion of the infection risk area has caused concern around the world. Currently, the disease control measures are based on the vector control, the genus Aedes mosquitoes and these were not effective, since the infection numbers have increased about 30 times in the last 50 years. Dengue viruses have four serotypes DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4 and infection with one serotype promote protective immunity against infection with the same serotype. In a second infection with a heterologous serotype, non-neutralizing antibodies produced in the first infection may increase the number of infected cells and thus exacerbate immune response. This phenomenon, known as ADE (antibody dependent enhancement) is related to the severe forms of the disease and for this reason, an effective vaccine against dengue should be tetravalent. This work aims to build a tetravalent DNA vaccine against dengue and additionally develop genetic adjuvants to enhance the immunogenicity of the vaccine. For this, DNA sequences corresponding to the domain III of the E protein of all four serotypes of dengue virus were cloned into the same expression vector. For the development of genetic adjuvants, genes of cytokines GM-CSF, IL-7 and IL-15 were separately cloned into the expression plasmid so that different associations of genetic adjuvants could be evaluated with the plasmid vaccine. The evaluation of the immunogenicity of the tetravalent vaccine DNA and its association with different adjuvants showed that there was a lymphoproliferative response against the proteins prM and E of DENV-3, and the splenocytes coming from the groups that received pVAX-EDIII1-4 and pVAX-IL15, pVAX-EDIII1-4 and pVAX- GMCSF and pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF and pVAX-IL7 showed higher response when re-stimulated in vitro. It can also be seen that B cells were increased in the groups vaccinated with pVAX-EDIII1-4 and pVAX-GMCSF and pVAX-EDIII1-4, pVAX-IL15 and pVAX-GMCSF. CD4+ T cell subpopulation was increased in the group immunized with pVAX-EDIII1-4 and pVAX-GMCSF while CD8 + T cells, in the group immunized with pVAX-EDIII1-4 and pVAX-IL7. We observed an increase in lymphocyte subpopulation of CD8 CD44+ CD62L- (effector memory-TEM) in the groups immunized with pVAX-EDIII1-4 and pVAX-IL7 and pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF and pVAX- IL7. Regarding the central memory (T CM - CD44+ CD62L+) CD4 and CD8 T cells the largest increase was in the group immunized with pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF and pVAX-IL15. The naïve CD4 and CD8 T cells are also increased in the group immunized with pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF and pVAX-IL15. In the neutralization test in vivo with DENV-2, there was 60% protection in animals that had neutralized the virus with the serum of animals immunized with pVAX-EDIII1-4 and pVAX-IL7; 40% protection in animals in which the virus neutralized by the serum of animals immunized with pVAX-EDIII1-4; pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF and pVAX-IL7; pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF and pVAX-IL15. In the same assay using DENV-1, we can observe that the group which virus was neutralized with serum from animals vaccinated with pVAX- EDIII1-4 and pVAX-IL7 survival was 80% and 60% in the groups receiving the neutralized virus with serum from animals vaccinated with pVAX-EDIII1-4, pVAX- EDIII1-4 and pVAX-GMCSF, pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF and pVAX-IL7 and pVAX-EDIII1-4, pVAX-GMCSF and pVAX -IL15. These results showed that DNA vaccine was able to induce an immune response and this response was aided by adjuvants tested.