Correlação entre as concentrações de BiP e de proteínas de reserva em sementes de soja

Abstract

O dobramento de proteínas secretórias no lúmen do retículo endoplasmático é altamente facilitado por chaperones moleculares. A proteína BiP é um dos chaperones mais bem caracterizados residentes do RE. BiP tem demonstrado ser um modulador multifuncional de vários processos que ocorrem no retículo endoplasmático. Essa proteína auxilia no dobramento e enovelamento das cadeias polipeptídicas nascentes e exerce papel no controle de qualidade do RE, reconhecendo e direcionando proteínas incorretamente dobradas para degradação. Também funciona como um sensor da via de resposta a proteínas incorretamente enovelada (UPR), regulando indiretamente a atividade da cinase eIF-2 e a sua própria expressão. As proteínas de reserva são sintetizadas em ribossomos associados à membrana do retículo endoplasmático, sendo co-traducionalmente translocadas para o lúmen do RE, onde podem permanecer associadas em corpos protéicos ou ser transportadas, via complexo de Golgi, para vacúolos de proteínas de reserva. Evidências na literatura indicam que BiP associa-se com proteínas de reserva in vitro, e seu acúmulo nas sementes está coordenado com a síntese de proteínas de reserva. Nesta investigação, foram analisados o nível de BiP nos diferentes estádios de desenvolvimento de sementes de soja e a correlação entre as concentrações de BiP e de proteínas de reserva de sementes. Para isso, utilizaram-se sementes de soja das variedades CAC-1 e CC3 com diferentes teores de proteína, determinados pelo método Kjeldahl. BiP acumulou-se predominantemente nos estádios iniciais de desenvolvimento das sementes, coincidindo com a síntese ativa de proteínas de reserva. O acúmulo temporal de BiP foi significativamente superior nas sementes CC3 que apresentam maior teor protéico. A capacidade de BiP associar-se a proteínas de reserva foi funcionalmente avaliada por meio do sistema duplo híbrido. Este ensaio demonstrou que BiP interage eficientemente com a subunidade de - conglicinina em leveduras. A partir desses resultados, surgiu a hipótese de que um aumento da expressão de BiP poderia resultar em elevação do teor de proteína das sementes. O efeito da superexpressão da proteína BiP no teor de proteína total foi diretamente avaliado em sementes de Nicotiana tabacum transgênicas (geração T4) superexpressando o gene BiP da soja. Embora o nível de BiP nas sementes transgênicas, detectado por immunoblotting e quantificado por densitometria, tenha sido maior nas linhagens transgênicas senso em relação às controle e anti-senso, a superprodução constitutiva de BiP não foi correlacionada diretamente com o aumento do teor protéico, determinado pelo método Kjeldahl. Esses resultados sugerem que a capacidade de processamento do retículo endoplasmático em tabaco durante o desenvolvimento da semente não constitui o fator limitante do processo de síntese e acúmulo de proteínas de reserva.

The folding of secretory proteins within the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) is greatly facilitated by molecular chaperones. The binding protein BiP is one of the best characterized ER-resident molecular chaperones. In mammalian cells, BiP has been demonstrated to serve as a multifunctional modulator of various ER-supported processes including regulation of eIF-2 kinase and mRNA translation, regulation of BiP expression, and the catalysis of protein folding, as well as, potentially, the targeting of misfolded proteins for degradation. The storage proteins from soybean are synthesized in ER membrane-bound polyribosomes and through a Golgi-mediated translocation are deposited into specialized vacuoles, designated protein bodies. We have previously demonstrated that BiP associated detectably with storage proteins in vitro and the efficiency of BiP synthesis correlated with the accumulation of seed storage protein, such that soybean cultivars that exhibited a greater content of storage proteins also accumulated higher levels of BiP. In this investigation, we further analyzed the synthesis of soybean BiP during seed development and the naturally occurring correlation between the content of BiP and seed storage proteins. Immunoblottings of total protein extracts from CAC1 (normal protein content) and CC3 (high protein content) cultivars demonstrated that, during the seed development, BiP accumulates to high levels at developmental stages that coincide with the onset of active storage protein synthesis. We further characterized the association of BiP and β-conglycinin storage proteins though the two-hybrid system. In order to understand whether an increase in BiP levels would promote a concomitant increase in seed storage protein accumulation, we obtained tobacco transgenic seeds-overexpressing a soybean BiP gene. The effect of BiP overexpression on total protein accumulation was directly evaluated in Nicotiana tabacum homozygous transgenic seeds (T3 generation). The BiP protein levels detected in the transgenic seeds were significantly higher than those of wild type and antisense BiP-transformed seeds. Nevertheless, total protein from seeds-overexpressing BiP, as determined by Kjeldahl, did not differ significantly from that of wild type and antisense seeds. These results suggest, although do not prove, that the capacity of ER processing during seed development does not constitute a rate limiting process for storage protein synthesis and accumulation.