Avaliação de três métodos de extração de DNA de Salmonella sp. em ovos de galinhas contaminados artificialmente

Abstract

Avaliou-se a eficiência de três protocolos para a extração de DNA genômico de bactérias do gênero Salmonella em ovos de galinhas livres de patógenos específicos SPF. Foram utilizados 75 ovos, divididos em cinco grupos com 15 ovos cada. Três grupos de ovos foram inoculados com culturas de Salmonella sp. Um quarto grupo foi inoculado com cultura de Escherichia coli. O quinto grupo foi o controle negativo, que recebeu solução salina 0,85% estéril. Os ovos ficaram incubados na temperatura em torno de 20 25 ºC durante 24 horas. Após esse intervalo foram colhidas cinco gemas de cada grupo, as quais foram homogeneizadas e centrifugadas por 10 minutos; o sobrenadante resultante foi descartado. Após o descarte, adicionou-se PBS pH 7,2 e centrifugou novamente-se novamente. O sedimento obtido de cada grupo foi utilizado na extração do DNA genômico bacteriano. Os métodos utilizados de extração foram: por partículas de sílica e um kit comercial GenElute Bacterial Genomic DNA kit (Sigma®). O DNA extraído foi mantido em temperatura de 20 ºC até a avaliação por PCR. Os primers utilizados são relacionados com o gene invA e resultaram em uma amplificação de 284 pares de base. Os produtos de amplificação foram visualizados em transluminador com luz ultravioleta. Os resultados demonstraram que o método de extração por partículas de sílica foi o mais eficiente, por obter um DNA de boa qualidade e quantidade suficiente para conseguir bons resultados na técnica de PCR.

The present study has assessed the efficiency of different protocols for the genomic DNA extraction of Salmonella in SPF (Specific Pathogen Free) hen eggs. Seventy-five eggs were divided into five groups of fifteen eggs. Three of these groups of eggs were inoculated with enteric Salmonella cultures. One of the five groups was inoculated with Escherichia coli bacterium culture. And the last group of eggs was the negative control group, which received saline solution 0.85% infertile. The eggs were incubated on a temperature that varied from 20 to 25 °C during 24 hours. Five yolks were c ollected from each group every 24 hours. These yolks were homogenized and centrifuged for 10 minutes. The supernatant was rejected. After that, PBS pH 7.2 was added and it was once again centrifuged. The sediment obtained from each group was used for the extraction of bacterial genomic DNA. The silica particle and commercial kit methods were used for extraction GenElute Bacterial Genomic DNA kit (Sigma®). The extracted DNA was kept under the temperature of 20 °C until PCR assessment. The primers used were related with the invA gene and resulted in 284 base pair amplification products. Such amplification products were visualized in UV transilluminator. Results showed that the silica particle extraction method was the most efficient one, since good quality and enough DNA was obtained to achieve good results with the PCR technique.