Análise funcional de genes de Phakopsora pachyrhizi candidatos a efetores utilizando o sistema EDV

Abstract

Os fungos causadores de ferrugens são parasitas obrigatórios que secretam diversas proteínas durante sua interação com plantas hospedeiras. Essas proteínas promovem o parasitismo por meio da manipulação do metabolismo do hospedeiro e interferência em suas respostas de defesa. As proteínas efetoras podem ser reconhecidas pelas proteínas codificadas pelos genes de resistência da planta, sendo, neste caso, denominadas proteínas de avirulência. Seis locos contendo genes que proporcionam diferentes graus de resistência à P. pachyrhizi (Rpp) já foram relatados e vários genes que codificam proteínas secretadas por esse fungo já foram identificados. No entanto, ainda não foram identificadas as proteínas efetoras (proteínas Avr) reconhecidas pelas proteínas Rpp de soja. Desse modo o objetivo deste trabalho foi identificar proteínas secretadas por P. pachyrhizi (PPUFV02), capazes de ativar ou suprimir respostas de defesa em soja, através de uma análise funcional de 10 genes candidatos a efetores, utilizando o SST3 de P. savastanoi pv. glycinea 1462 (sistema EDV). Dos dez efetores testados nos 11 genótipos de soja resistentes ao isolado monopostular de P. pachyrhizi PPUFV02, fonte dos genes candidatos, PHPA_RSP_71 se destacou por contribuir para uma maior severidade da doença no genótipo PI 594538-A e menor no genótipo PI 594754. O efetor PHPA_RSP_23 também se mostrou interessante para novos estudos funcionais em soja e tabaco, uma vez que os resultados indicaram possível ativação de resposta de defesa em soja de forma geral (em todos os genótipos) e possível supressão de morte celular em tabaco. A atividade efetora desses genes candidatos não foi confirmada pela análise de crescimento bacteriano em soja e em tabaco (planta não hospedeira). Por outro lado, há uma possibilidade de esses efeitos serem devido a uma interferência do efetor com a funcionalidade do SST3, necessitando-se de estudos de secreção da proteína para confirmar ou refutar estas hipóteses. De forma geral o genótipo Williams 82 se mostrou resistente à Psg 1462, podendo ser utilizado como controle negativo para doença nas análises funcionais. Não foi possível confirmar N. benthamiana como uma planta adequada para estudos funcionais de indução/supressão de HR ao se utilizar Psg 1462, uma vez que é possível que este isolado bacteriano seja patogênico a esta espécie. O vetor pEDV6 de forma geral apresentou estabilidade nos clones Psg1462(pEDV6::PHPA_RSP) e não alterou a capacidade de multiplicação da bactéria in planta, confirmando o EDV como um bom sistema para análise funcional de genes de P. pachyrhizi candidatos a efetores em soja, utilizando o SST3 de Psg 1462. O método de inoculação por mergulho não se mostrou adequado para as análises funcionais em soja, uma vez que apresentou de forma geral alta variabilidade nos resultados, sendo o método de inoculação a vácuo mais indicado para este fim por ter apresentado maior uniformidade na severidade dos sintomas observados.

Rust fungi are obligate parasites that secrete diverse proteins during their interaction with host plants. These proteins promote parasitism by manipulating the host metabolism and interfering with its defense responses. Effector proteins can be recognized by proteins coded by plant resistance genes, in which case they are called avirulence proteins. Six loci containing genes that confer varying degrees of resistance to P. pachyrhizi (Rpp) have been reported, and several genes encoding proteins secreted by the fungus have been identified. However, effector proteins (Avr proteins) recognized by soybean Rpp proteins have not yet been identified. Thus, the objective of this study was to identify proteins secreted by P. pachyrhizi (PPUFV02) able to activate or suppress defense responses in soybean, through the functional analysis of ten candidate effector genes using the TTSS of P. savastanoi pv. glycinea 1462 (EDV system). Among the ten effectors tested in 11 soybean genotypes resistant to the mono-pustule isolate PPUFV02 of P. pachyrhizi, source of candidate genes, PHPA_RSP_71 stood out for contributing to greater disease severity in genotype PI 594538- A and lower in genotype PI 594754. The PHPA_RSP_23 effector was also interesting for additional functional studies on soybean and tobacco, since the results indicated a possible activation of defense response in soybean, in general (all genotypes), and a possible suppression of cell death in tobacco. The effector activity of these candidate genes was not confirmed by analysis of bacterial growth in soybean and tobacco (non-host plant). On the other hand, it is possible that these effects are due to an interference of the effector with the function of the TTSS, making it necessary to conduct protein secretion assays to confirm or reject these hypotheses. Overall, the genotype Williams 82 showed resistance to Psg 1462 and can be used as negative control for disease in functional analysis in soybean. It was not possible to confirm N. benthamiana as an appropriate plant for functional studies of induction/suppression of HR when using Psg 1462, since it is possible that the bacterial isolate is pathogenic to this species. The pEDV6 vector in general was stable in the Psg1462(pEDV6::PHPA_RSP) clones and did not alter the ability of the bacteria to multiply in planta, confirming the EDV as a good system for functional analysis of P. pachyrhizi candidate effector genes in soybean using TTSS of Psg 1462. The inoculation method by dipping was not suitable for functional analysis in soybean because, in general, showed highly variable results. The inoculation method by vacuum was the best suited for this purpose, since it introduced greater uniformity in the severity of symptoms observed.