Efeito da proteína Hfq em vesículas de membrana externa produzidas por Actinobacillus pleuropneumoniae sorotipo 8

Abstract

A suinocultura é uma atividade de grande importância econômica no Brasil e no mundo. O Estado de Minas Gerais é um dos principais produtores de carne suína, apresentando constante crescimento. Na suinocultura, podem-se relatar diversas doenças respiratórias que acometem suínos, sendo um dos mais importantes a bactéria Actinobacillus pleuropneumoniae. Em A. pleuropneumoniae vários fatores de virulência como LPS, cápsula, toxinas RTX e proteínas de captação de ferro, contribuem de diferentes maneiras e de forma complexa para o sucesso desta bactéria durante a infecção. Um fator de virulência muito importante em diversas bactérias, porém pouco relatado em A. pleuropneumoniae são as vesículas de membrana externa (OMVs). As OMVs são vesículas produzidas geralmente por bactérias Gram-negativas, constituídas de proteínas, lipídeos e lipopolissacarídeos. Elas podem transportar diferentes moléculas como proteínas, íons, DNA e RNA, participando na virulência de diversas espécies. Além dos fatores mencionados, um fator muito importante para A. pleuropneumoniae é a proteína Hfq, uma chaperona de RNAs que possui papel central no crescimento e virulência desta bactéria. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi caracterizar OMVs produzidas por A. pleuropneumoniae sorotipo 8 e sua respectiva linhagem isogênica Δhfq. O perfil de proteínas foi diferencial entre as células e as OMVs, no entanto não houve diferença entre o perfil proteico encontrado nas OMVs produzidas pelas linhagens WT e Δhfq. Não foi possível identificar a proteína Hfq em OMVs de A. pleuropneumoniae. As análises microscópicas realizadas evidenciaram que as vesículas possuem um tamanho predominante entre 20-30 nm podendo chegar até 100 nm. O ensaio de virulência não apresentou diferença em relação à sobrevivência para as larvas de Galleria mellonella infectadas com OMVs de WT em relação às infectadas com OMVs de Δhfq. Porém, larvas infectadas com OMVs apresentaram melanização mais rápida e intensa em relação às larvas infectadas com as células. No interior das OMVs foi possível identificar RNAs, incluindo RNAs pequenos regulatórios, já previamente estudados por nosso grupo, porém não foi observado diferença na composição destes encontrados em OMVs produzidos por WT e Δhfq. A partir destes resultados pode-se concluir que a proteína Hfq não interferiu na virulência, morfologia e composição das OMVs produzidas por A. pleuoropneumoniae. Este estudo foi o primeiro a relatar a presença de RNAs regulatórios no interior de OMVs produzidas por uma bactéria patogênica de suíno da família Pasteurellaceae.

Pig farming is an activity of great economic importance in Brazil and worldwide. Minas Gerais is one of the main producers of pork, showing constant growth. In pig industry, several respiratory diseases affecting pigs can be reported, one of the most important being the bacterium Actinobacillus pleuropneumoniae. In A. pleuropneumoniae several virulence factors such as LPS, capsule, RTX toxins and iron uptake proteins, contribute in different and complex ways to the success of this bacterium during infection. A very important virulence factor in several bacteria, but little reported in A. pleuropneumoniae are the outer membrane vesicles (OMVs). OMVs are vesicles generally produced by Gram-negative bacteria, consisting of proteins, lipids and lipopolysaccharides. They can trasnport different molecules like proteins, ions, DNA and RNA, participating in the virulence of several species. In addition, a very important factor for A. pleuropneumoniae is the Hfq protein, a chaperone of RNAs that plays a central role in the growth and virulence of this bacterium. Thus, the objective of this work was to characterize OMVs produced by A. pleuropneumoniae serotype 8 and their respective Δhfq isogenic strain. The proteins profile was differentiated between the cells and the OMVs, however there was no difference between the protein profile found in the OMVs produced by the WT and Δhfq strains. It was not possible to identify the Hfq protein in OMVs of A. pleuropneumoniae. The microscopic analysis showed that the vesicles have a predominant size between 20-30 nm and can reach up to 100 nm. The virulence assay showed no difference in survival for Galleria mellonella larvae infected with WT OMVs compared to those infected with Δhfq OMVs. However, larvae infected with OMVs showed faster and more intense melanization in relation to the larvae infected with the cells. In the OMVs it was possible to identify RNAs, including small regulatory RNAs previously studied by our group, but no difference was observed in the composition of these OMVs produced by WT and Δhfq stains. From these results it can be concluded that the Hfq protein did not interfere in the virulence, morphology and composition of OMVs produced by A. pleuoropneumoniae. This study was the first to report the presence of regulatory RNAs within OMVs produced by a pathogenic swine bacterium of the family Pasteurellaceae.