Produção, purificação e caracterização de enzimas lignocelulolíticas e lipolíticas fúngicas produzidas em resíduo de macaúba (Acrocomia aculeata)

Abstract

Espécies de basidiomicetos possuem a capacidade de crescer em uma série de resíduos agrícolas produzindo um complexo enzimático composto por várias enzimas lignocelulolíticas. Neste trabalho os fungos Lentinula edodes isolado UFV 73, Pleurotus ostreatus isolados PLO 02 e PLO 06, e Pleurotus eryngii isolado PLE 05, foram avaliados quanto a capacidade de produzirem enzimas lignocelulolíticas e lipolíticas quando crescidos em resíduo de coco de macaúba, e se essa produção era afetada pelo tempo de crescimento nesse substrato. Foi realizada a extração da proteína bruta (EEB) e este extrato foi submetido à purificação por cromatografia por exclusão molecular e posterior caracterização das enzimas quando à temperatura, pH, concentração do substrato e estabilidade térmica. Também foi avaliado se os fungos deste estudo apresentariam crescimento em meio mineral sólido no qual a única fonte de carbono foi óleo de oliva. Todos formaram halo alaranjado em meio com rodamina B, indicando a capacidade desse fungo em produzir enzimas com atividade lipolítica. O isolado UFV 73 apresentou atividade máxima de celulase, xilanase, lipase, lacase e manganês peroxidase (MnP) aos 37 dias de incubação. Após as etapas de purificação foram obtidos rendimentos de 489% (Lacase), 264% (MnP), 105% (celulase) e 9,5% (xilanase) em relação ao EEB. A faixa de pH ótimo variou entre as enzimas, sendo que lacase e lipase tiveram atividade máxima em pH 3 e 7, respectivamente. MnP, lacase e lipase tiveram atividade diretamente proporcional ao aumento da temperatura, enquanto, a atividade de celulase e xilanase não teve alteração em função desse parâmetro. A temperatura de maior atividade para MnP e lacase foi de 30 ºC, 42 ºC para lipase, 45 ºC para xilanase, e a celulase manteve-se estável em todas as temperaturas analisadas. Entre os isolados de Pleurotus, o isolado PLO 02 foi o que apresentou maiores atividades de lacase e xilanase, enquanto o isolado PLO 06 foi o que apresentou maiores atividades de lignina peroxidase, manganês peroxidase, celulase e lipase. O melhor resultado na purificação foi para a lacase alcançando rendimento de 105% (PLO 02), 315% (PLE 05) e 504% (PLO 06). As enzimas dos fungos do gênero Pleurotus apresentaram atividade constante em todas as temperaturas analisadas, na qual apenas lignina peroxidase e lipase tiveram picos de atividade em temperaturas próximas a 30 ºC. As melhores atividades para as enzimas lacase, celulase e lipase de Pleurotus ssp. foram em pH 3. A xilanase permaneceu constante em todas as faixas de pH analisadas. A LiP e a MnP tiveram pico de atividade em pH 7. De uma forma geral, a atividade das enzimas de todos os isolados diminuiu nas primeiras duas horas de incubação (redução média de 79 % na atividade de celulase, 64% na de xilanase, 85% na de MnP, 87% na de lacase, 75% na de lipase e 71% na de LiP), permanecendo constante após esse período até as 16 h. As enzimas de todos os isolados seguiram a cinética de Michaelis-Menten. Dentre todos os fungos testados quanto a capacidade de degradar o corante índigo, o EEPP de PLE 05 foi o que demonstrou maior potencial para descoloração, alcançando uma eficiência de 100% após 24 h. Este é o primeiro estudo utilizando resíduos de coco de macaúba para a produção de enzimas lignocelulolíticas e lipases, através da fermentação em estado sólido por estes fungos, os quais apresentam alto potencial de utilização desses resíduos para a produção de enzimas.

The species of basidiomycetes are an able to grow in agricultural residues by producing an enzymatic complex composed of lignocellulolytic enzymes. In this work, the fungi Lentinula edodes isolate UFV 73, Pleurotus ostreatus isolates PLO 02 and PLO 06, and Pleurotus eryngii isolate PLE 05 were evaluated for the ability to produce lignocellulolytic and lipolytic enzymes when grown in coconut residue of macaw palm, and if this production was affected by the growth time in this substrate. The crude protein (CEE) was extracted and this extract was purified by chromatography of molecular exclusion, and the enzymes where characterized according to temperature, pH, substrate concentration and thermal stability. It was also evaluated if fungi of this study were able to grow in solid mineral medium, in which the only source of carbon was olive oil. All of them formed orange halo in medium with rhodamine B, indicating the ability of this fungus to produce enzymes with lipolytic activity. UFV 73 showed maximum activity of cellulase, xylanase, lipase, laccase and manganese peroxidase (MnP) at 37 days of incubation. After the purification steps, increasing of yields of 489% for laccase, 264% for MnP, 105% for cellulase and 9.5% for xylanase were obtained in relation to CEE. The optimum pH range varied among the enzymes, and laccase and lipase presented maximum activity at pH 3 and 7, respectively. MnP, laccase and lipase presented activity directly proportional to the temperature increase, whereas the activity of cellulase and xylanase did not change as a function of this parameter. The highest activity for MnP and laccase was at 30 °C, 42 °C for lipase, 45 °C for xylanase, and for cellulase remained stable at all temperatures analyzed. Among Pleurotus isolates, PLO 02 showed the highest laccase and xylanase activity, while the PLO 06 showed the highest activity of lignin peroxidase LiP, MnP, cellulase and lipase. The best purification result was for laccase, achieving yield to 105% for PLO 02, 315% for PLE 05 and 504% for PLO 06. All enzymes of the Pleurotus isolates tested showed constant activity at all temperatures, in which only lignin peroxidase and lipase had peaks of activity at temperatures close to 30 ºC. The best activities for the laccase, cellulase and lipase enzymes of Pleurotus ssp. were at pH 3. The xylanase remained constant in all analyzed pH ranges. The LiP and MnP showed peak activity at pH 7. In general, the activity of the enzymes of all isolates decreased in the first two hours of incubation (mean reduction of 79% for cellulase, 64% for xylanase, 85% for MnP, 87% for laccase, 75% for lipase and 71% for LiP), remaining constant after this period during 16 h. The enzymes of all isolates followed the Michaelis-Menten kinetics. Among all the fungi tested for the ability to degrade the indigo dye, the PLE 05 PPEE showed the greatest potential for discoloration, reaching an efficiency of 100% after 24 h. This is the first study using coconut residues of macaw palm for production of lignocellulolytic enzymes and lipases, through the solid state fermentation by these fungi, which present high potential of use of these residues for the production of enzymes.