Caracterização em escala genômica de fitases fúngicas, otimização da produção e expressão da fitase de Talaromyces pinophilus

Abstract

Os alimentos de origem vegetal utilizados nas rações para animais possuem ácido fítico ou fitato, um fator antinutricional, devido à sua capacidade de se ligar a cátions e macromoléculas impossibilitando a absorção desses nutrientes pelos animais. Os animais não ruminantes não sintetizam ou produzem níveis insuficientes de fitase, enzima capaz de catalisar a hidrólise do fitato. Sendo assim, objetivou-se avaliar o potencial de fungos fitopatogênicos e habitantes de solo de expressão e secreção de fitases com potecial para aplicação biotecnológica na produção de ração. Dessa forma, foram selecionados doze fungos, entre ascomicetos e basidiomicetos, para uma caracterização em escala genômica por meio de uma predição in silico das sequências dessas enzimas. Cinquenta sequências com potencial de hidrólise do fitato foram identificadas, sendo que, trinta são classificadas como fitases pertencentes às famílias beta-hélice e das fosfatases ácidas de histidina, possibilitando o entendimento da identidade enzimática, mostrando as diferenças entre estas famílias de fitase. Os resultados sugerem que, além das fitases pertencentes à família das fosfatases ácidas de histidina, alguns fungos ascomicetos selecionados podem secretar fitases da família beta-hélice. Entre os microrganismos estudados, o fungo Talaromyces pinophilus foi selecionado para a otimização produção de fitase por meio da metodologia de superfície de resposta, utilizando casca de soja como substrato. Pela metodologia de superfície de resposta foi possível otimizar a produção da fitase pelo T. pinophilus, se mostrando uma ferramenta fundamental nesse processo ao fornecer modelos matemáticos confiáveis. A concentração de peptona e o tempo de cultivo foram os fatores que possuiram maiores efeitos nas atividades enzimáticas, tanto em U/mL como em U/mg. Enquanto a presença do cloreto de cálcio no meio promoveu uma redução na atividade. Os códons otimizados do gene 7227 do fungo T. pinophilus foram clonados e expressos em sistema heterólogo em P. pastoris. A espectrometria de massa foi utilizada para identificação da proteína recombinante confirmando a expressão. A enzima recombinate do clone 2 apresentou melhor atividade específica com 36 h de cultivo, temperatura ótima de 55° C em pH 6,0 e permaneceu estável em diferentes valores de pH (3,0-6,0), demonstrando potencial para aplicação na indústria de rações.

Vegetals used in the animal feed have phytic acid or phytate, an antinutritional factor due to ability to bind to cations and other macromolecules, which hamful its the absorbtion of nutrients by animals. Non-ruminant animals do not synthesize or insufficiently synthesize phytase, an enzyme capable of catalyzing phytate hydrolysis. Thus, the objective was to evaluate the potential of phytopathogenic fungi and soil inhabitants of expression and secretion of phytases with potecial for biotechnological application in feed production. Thus, twelve fungi were selected for genomic scale characterization through an in silico prediction of the sequences of these enzymes. Fifty sequences with phytate hydrolysis potential were identified, and thirty are classified as phytases belonging to the beta- propeller families and histidine acid phosphatases, allowing the understanding of the enzymatic identity, showing the differences between these phytase families. The results suggest that, in addition to phytases belonging to the histidine acid phosphatase family, some selected ascomycete fungi may secrete beta-propeller phytases. Among the microorganisms studied, the fungus Talaromyces pinophilus was selected for the phytase production optimization by the response surface methodology, using soybean hull as substrate. By the response surface methodology it was possible to optimize the phytase production by T. pinophilus, proving to be a fundamental tool in this process by providing reliable mathematical models. Peptone concentration and cultivation time were the factors that had the greatest effects on enzymatic activities, both in U/mL and U/mg. While the presence of calcium chloride in the medium promoted a reduction in activity. Optimized codons of the 7227 T. pinophilus gene were cloned and expressed in a heterologous system in P. pastoris. Mass spectrometry was used to identify the recombinant protein confirming the expression. Clone 2 recombinant enzyme showed better specific activity with 36 h of culture, optimal temperature of 55 °C at pH 6.0 and remained stable at different pH values (3.0-6.0), demonstrating potential for application in feed industry.