Parâmetros reprodutivos em touros: análise proteômica do plasma seminal e teste de congelabilidade do sêmen

Abstract

Na espécie bovina existem animais que acumulam espermatozoides senescentes na cauda do epidídimo, devido a abstinência sexual, esses animais caracterizam-se por ejacularem grande volume de sêmen com baixa motilidade espermática e que com coletas consecutivas tem o aumento gradual dessa característica. Essa condição se apresenta principalmente em touros criados sob manejo extensivo, e o uso desses animais pode diminuir a eficiência reprodutiva durante a estação de monta (BARTH 2007). O plasma seminal é uma mistura bioquimicamente complexa e que tem importância significativa na regulação da função espermática. Diante disso, o objetivo desse estudo foi identificar o perfil proteômico em ejaculados de touros aprovados e em repouso sexual imediatamente após a avaliação do primeiro ejaculado. Foram utilizados seis touros em repouso sexual, e dois animais como controle. Três grupos foram formados, sendo o grupo A constituído por amostras do sêmen da primeira coleta dos touros em repouso sexual; grupo B: amostra de sêmen da última coleta dos touros em repouso sexual; e grupo C: amostra de sêmen dos touros controle. Todos os touros foram submetidos à avaliação andrológica pelo método de eletroejaculação e foram avaliados os aspectos físicos e morfológicos dos ejaculado por meio de microscopia óptica convencional e de contraste de fase. Depois das análises, os ejaculados foram centrifugados e os sobrenadantes (plasma seminal) foram usados para estudo proteômico. Depois da centrifugação, as proteínas do plasma seminal foram quantificadas pelo método de Bradford e analisadas por meio de eletroforese monodimensional e espectrometria de massas (LC-MS/MS). As proteínas foram identificadas pelo MASCOT e validadas estatisticamente usando o software SCAFFOLD Q+. As proteínas foram caracterizadas de acordo a suas classes e processos biológicos pelo STRAP usando os termos de ontologia gênica depositados no banco de dados UniprotKB. As proteínas diferencialmente abundantes foram quantificadas pelo método emPAI considerando unicamente aquelas proteínas com foldchange superior a 1,5 vezes. Os dados referentes à motilidade espermática foram submetidos à transformação angular (Y^'=arcsen√Y). As variáveis quantitativas foram analisadas por ANOVA. As variáveis qualitativas foram analisadas pelo teste de Kruskal-Wallis. O nível de significância adotado foi α = 5%. Foram encontratros 1,67% de touros em repouso sexual (7/419). Houve diferença (p<0,05) em relação à motilidade, vigor e turbilhonamento espermático entre os grupos, porém não houve diferença das características morfológicas. Na análise proteômica foram identificadas 93 proteínas no plasma seminal. A maioria delas envolvidas no processo celular (36,22%), regulação biológica (35,20%) e interação celular (19,12%). Das proteínas identificadas 6 foram diferencialmente expressas entre o grupo A e B (ALBU, NPC2, Z13, SPAD1, CCL2, F1N1Z8), e 4 (Q4R0H2, SPAD1, NPC2 e Z13) foram diferencialmente expressas entre B e C. Em relação às funções moleculares das proteínas, as principais funções foram de ligação (49,50 %) e atividade catalítica (35,34%). Palavra-chave: Andrologia. Cruzamento. Sêmen

In bovine species there are animals that accumulate senescent sperm in the tail of the epididymis, due to sexual abstinence, these animals are characterized by ejaculating large volume of semen with low sperm motility and that with consecutive collections has the gradual increase of this characteristic. This condition occurs mainly in bulls reared under extensive management, and the use of these animals may decrease reproductive efficiency during the breeding season. Seminal plasma is a biochemically complex mixture that is of significant importance in regulating sperm function. Therefore, the objective of this study was to identify the proteomic profile in ejaculates of approved bulls and in sexual rest immediately after the evaluation of the first ejaculate. Six bulls were used in sexual rest, and two animals as control. Three groups were formed, and group A consisted of semen samples from the first collection of the resting bulls; group B: semen sample from the last collection of bulls at sexual rest; and group C: semen sample from control bulls. All bulls were submitted to andrological evaluation by the electroejaculation method and the physical and morphological aspects of the ejaculate were evaluated by conventional optical microscopy and phase contrast. After the analyzes, the ejaculates were centrifuged and the supernatants (seminal plasma) were used for proteomic study. After centrifugation, seminal plasma proteins were quantified by the Bradford method and analyzed by one-dimensional electrophoresis and mass spectrometry (LC-MS / MS). The proteins were identified by MASCOT and statistically validated using SCAFFOLD Q + software. Proteins were characterized according to their classes and biological processes by STRAP using the gene ontology terms deposited in the UniprotKB database. Differentially abundant proteins were quantified by the emPAI method considering only those proteins with foldchange greater than 1.5 times. The sperm motility data were submitted to angular transformation (Y ^ '= arcsen√Y). Quantitative variables were analyzed by ANOVA. Qualitative variables were analyzed by the Kruskal-Wallis test. The significance level adopted was α = 5%. A total of 1.67% (7/419) of sexually resting bulls were found. There was a difference (p <0.05) in relation to motility, vigor and sperm swirling between the groups, but there was no difference in morphological characteristics. In proteomic analysis 93 proteins were identified in seminal plasma. Most of them involved in the cellular process (36.22%), biological regulation (35.20%) and cellular interaction (19.12%). Of the identified proteins 6 were differentially expressed between group A and B (ALBU, NPC2, Z13, SPAD1, CCL2, F1N1Z8), and 4 (Q4R0H2, SPAD1, NPC2 and Z13) were differentially expressed between B and C. The main molecular functions of proteins were binding (49.50%) and catalytic activity (35.34%). Keywords: Andrology. Crossbred. Semen