Propriedades bioquímicas e cinético-enzimáticas de cisteíno- proteases do intestino médio da lagarta da soja

Abstract

Inibidores de protease que atuam em proteases específicas de insetos são candidatos para terem seus códigos genéticos inseridos em plantas geneticamente modificadas. Um primeiro passo para se alcançar isso é a caracterização das enzimas proteolíticas do intestino desses insetos. Cisteíno-proteases da Fração solúvel e da Fração insolúvel do intestino médio de Anticarsia gemmatalis foram caracterizadas utilizando o substrato L-BApNA. A Fração solúvel, chamada de Fração I, foi obtida do sobrenadante após nove ciclos de congelamento e descongelamento do intestino de A. gemmatalis e a Fração insolúvel, chamada de Fração II, obtida da maceração com o detergente Brij 35 do pellet resultante da Fração I. Verificaram-se dois valores de pH com pronunciada atividade em ambas as Frações, sendo eles pH 3,6 e 8,0 para a Fração I e 4,6 e 8,0 para a Fração II. Já o pico de atividade quando testada a influência da temperatura foi em 35oC para a Fração I e 60°C para a Fração II. O KM app encontrado para as Frações I e II foram de 2,28 mM e 0,44 mM respectivamente. A Vmáx app para as respectivas Frações foram 297,68 nM.s-1 e 122,95 nM.s-1. Quatro inibidores de proteases foram testados, sendo cada um deles de uma classe de protease: TLCK (inibidor de serino-protease), E-64 (inibidor de cisteíno-protease), EDTA (inibidor de metaloprotease) e Pepstatina A (inibidor de aspartil- protease). A inibição mais pronunciada foi verificada quando E-64 foi adicionado ao meio para ambas as Frações, uma vez que todas as concentrações testadas diminuíram significativamente a atividade de cisteíno-protease. Um aumento de TLCK no meio fez com que a atividade de cisteíno-protease caísse gradativamente devido à reação desse com resíduo de aminoácido histidina na tríade catalítica, o qual faz parte de tríade de cisteíno-protease também. O efeito de EDTA na atividade de cisteíno-protease de A. gemmatalis sobre L-BApNA mostra a diferença entre as duas Frações analisadas. A Fração I não depende de íons divalentes como Ca2+ para sua atividade. Já a Fração II é cálcio-dependente, pois EDTA diminuiu significativamente sua atividade. Pespstatina A não influenciou cisteíno-proteases da Fração I, exercendo pouca influência na Fração II.

Protease inhibitors that react with insect specific proteases are candidates to have their genetic code inserted in genetically modified plants. The first step to achieve this is the characterization of proteolytic enzymes of these insects intestines. Cysteine-protease of the soluble and insoluble fractions from the midgut of Anticarsia gemmatalis were characterized using the substrate LBApNA. The Soluble Fraction, called Fraction I, was obtained from the suspension medium after nine cycles of freezing and thawing of the intestine of A. gemmatalis, and the Insoluble Fraction, called Fraction II, was obtained from the maceration with detergent Brij 35 of the resulting pellet of the Fraction I. Two pH values were found with high activity in both Fractions they were pH 3.6 and 8.0 for the Fraction I and 4.6 and 8.0 for the Fraction II. And the peak of activity when tested the influence of temperature was at 35oC for the Fraction I and 60°C for the Fraction II. The KM app found for the Fractions I and II were 2.28 mM and 0.44 mM, respectively, and the Vmax app for the respective Fractions were 297.68 nM.s-1 and 122.95 nM.s-1. Four protease inhibitors were tested, which one from one class of protease: TLCK (inhibitor of serine-protease), E-64 (inhibitor for cysteine-protease), EDTA (inhibitor of metallo-protease) and Pepstatin A (inhibitor of aspartyl-protease). The higher inhibition was observed when E-64 was added to the medium for both Fractions, once that all concentrations tested decreased significantly the activity of cysteine- protease. An increase of TLCK into the medium made a gradual decrease in the activity of cysteine-protease, due to the reaction with the amino acid histidine residue in the catalytic triad, which is also part of the triad of cisteine-protease. The effect of EDTA in the activity of cysteine-protease of A. gemmatalis on L-BApNA shows the difference between the two Fractions analyzed. The Fraction I do not depend on the divalent ions as Ca2 + for its activity. However, the Fraction II is a calcium- dependent, since EDTA reduced significantly its activity. The Pespstatin A did not influenced the cysteine-proteases of the Fraction I, exerting little influence on the Fraction II.