Avaliação de imunogenicidade de camundongos BALB/c após inoculação com proteína ligante de heparina de Leishmania chagasi

Abstract

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença causada por parasitos intracelulares da espécie L. infantum/chagasi. Esses protozoários possuem um forte tropismo por órgãos viscerais, nos quais se proliferam e causam graves lesões podendo resultar em óbito do paciente se não for tratada. Moléculas presentes no parasito consideradas como fatores de virulência vêm sendo intensamente pesquisadas. Entre elas estão as proteínas ligantes de heparina (PLH), que são glicoproteínas relacionadas em diversos trabalhos da literatura com o processo de adesão entre células. Nesse trabalho utilizamos a PLH de L. chagasi (PLHLc) em experimentos de imunização de camundongos BALB/c para avaliar sua imunogenicidade. Foram avaliadas a proliferação celular, produção de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-10), de óxido nítrico (NO) e dos isotipos de anticorpos IgG1/IgG2a após a imunização com PLHLc associada ou não com Adjuvante Incompleto de Freud (AIF). Os animais foram imunizados por via intraperitoneal, sendo submetidos a duas doses de reforço utilizando o mesmo protocolo da primeira imunização. Antes de cada imunização o sangue foi coletado para a obtenção de soro e posterior dosagem de IgG1 e IgG2a. Duas semanas após o último reforço, os camundongos foram eutanasiados e o baço foi coletado para o ensaio de linfoproliferação e análise da produção de citocinas e NO por ELISA e pelo método de Griess, respectivamente. Nossos resultados mostraram que esplenócitos do grupo tratado com PLHLc, após estímulo in vitro com antígeno particulado de L. chagasi (AgLc) ou com PLHLc, apresentaram aumento de linfoproliferação e de produção de IFN-γ, IgG2a, NO e IL-10 em relação aos do grupo não tratado, porém com níveis mais altos de produção de IFN-γ e mais baixos de IgG1, quando comparado com os do grupo vacinado com PLHLc + AIF. Já o grupo PLHLc + AIF, sob as mesmas condições de estímulo in vitro, apresentou um aumento de linfoproliferação e dos níveis de IFN-γ, NO, IL-4, IgG2a, IgG1 e IL-10 no baço quando comparados com os resultados do grupo não vacinado. Como podemos observar, foram obtidos dois perfis distintos de resposta imune durante as imunizações, sendo um perfil Th1 observado no grupo imunizado somente com a PLHLc e um perfil misto Th1/Th2 quando a proteína foi utilizada associada ao adjuvante nos experimentos. Os dois perfis obtidos são relatados na literatura com a proteção contra a LV. Esses resultados mostram que a PLHLc é um forte candidato a antígeno vacinal para o uso em formulações vacinais, e que experimentos adicionais são necessários para avaliar a capacidade de proteção contra desafios por L. chagasi para o uso da PLHLc no controle da LV.

Visceral leishmaniasis (VL) is a disease caused by the intracellular protozoan Leishmania infantum/chagasi. This protozoa exhibit a strong tendency to invade the viscera causing severe lesions, which may result in patient death if not treated. Molecules in the parasite, considered as virulence factors, have been intensively searched. Among them are heparin-binding proteins (HBP), glycoproteins that are related in many works of the literature with the process of adhesion between cells. In this work, we used L. chagasi HBP (HBPLc) in immunization experiments using BALB/c mice to evaluate immunogenicity of the protein. Thus, we evaluate the cell proliferation and cytokines (IFN-γ, IL-4 and IL-10), NO and antibody isotypes IgG1 and IgG2a production following immunization with L. chagasi HBP (HBPLc), associated or not with Incomplete Freund s Adjuvant (IFA). The mice were intraperitoneally immunized and submitted two times to booster doses using the same protocol of the first immunization. Before each immunization, blood was collected to obtain serum for the dosage of the antibody isotypes IgG1 and IgG2a. Two weeks after the second booster, the animals were euthanized and the spleen was collected for lymphoproliferation assay, analysis of cytokines and NO production by ELISA and Griess method, respectively. Our results showed that spleen cells from HBPLc vaccinated group after in vitro stimulus with crude extract of L. chagasi (AgLc) or with HBPLc showed an increase in cell proliferation and IFN-γ, IgG2a, NO and IL-10 production if compared with spleen cells from non-vaccinated group, but with higher levels of IFN-γ and lower levels of IgG1 if compared with spleen cells from HBPLc + IFA vaccinated group submitted to the same stimulus. Otherwise, HBPLc + IFA vaccinated group, under the same in vitro stimuli conditions above, showed higher levels of lymphoproliferation and IFN-γ, NO, IL-4, IgG2a, IgG1 and IL-10 in the spleen if compared with the results obtained from non-vaccinated group. As can be seen, two distinct profiles of immune response after immunizations were obtained, being a Th1 profile observed in the group immunized only with HBPLc and Th1/Th2 mixed profile when the protein was associated with IFA. These results show that HBPLc is a candidate antigen for use in vaccine formulations and additional experiments to evaluating the performance of protection against L. chagasi challenge should be conducted to evaluate the use of HBPLc in the control of LV.