Caracterização bioquímica de cocos Gram-positivos isolados de salame tipo italiano para uso como culturas starter: atividade antagonista, atividade de catalase e de nitrato redutase e produção e degradação de aminas biogênicas

Abstract

Noventa e oito estirpes de bactérias Gram-positivas, em sua maioria estafilococos coagulase negativos, oriundas de salames tipo italiano produzidos por fermentação artesanal e por fermentação industrial, foram caracterizadas quanto a aspectos relacionados ao seu uso em culturas starter. Foi avaliada a atividade antagonista contra bactérias patogênicas e a provável natureza protéica das substâncias inibidoras foi evidenciada pela redução da inibição na presença de protease. Cinquenta e um isolados apresentaram atividade antagonista contra Listeria monocytogenes, dos quais 27 com ação por substância de natureza protéica. Trinta e sete isolados demonstraram atividade antagonista contra Staphylococcus aureus, dos quais 30 com ação por substância de natureza protéica. Dezesseis estirpes de estafilococos, pertencentes às espécies S. capitis subsp. capitis, S. caprae, S. arlettae e S. delphini, tiveram ação antagonista por substância de natureza protéica sobre ambas as bactérias indicadoras. Todos os 98 isolados exibiram atividade de catalase, verificada pelo consumo de peróxido de hidrogênio, sendo 46% com níveis altos de degradação de H2O2, com valores acima de 28,32 μmoles de H2O2 degradado.min-1.mL-1 de suspensão de células com D.O630 nm = 1,0. Sessenta e oito isolados reduziram nitrato a nitrito em ensaio em ágar contendo KNO3, dos quais 44% com atividade de nitrato redutase elevada, com halos característicos de redução de nitrato acima de 12 mm. Onze isolados oriundos dos salames artesanais, pertencentes às espécies S. xylosus, S. arlettae e S. equorum, exibiram elevadas atividades de nitrato redutase e catalase simultaneamente, podendo ser importantes componentes de consórcios para produção de salame. Observou-se uma baixa incidência de genes codificadores de enterotoxinas estafilocócicas, detectados por reação em cadeia de polimerase (PCR), com exceção do gene see presente em 23,5% dos isolados. Quatro isolados apresentaram os genes seb e seh simultaneamente; dois isolados, apenas o gene seh; e um isolado, o gene sej. Os genes sea, sec e sed não foram encontrados em nenhum dos 98 isolados. O gene see foi detectado em nove dos onze isolados com elevadas atividades de nitrato redutase e catalase; os outros dois, as estirpes de S. xylosus CIL 28 e de S. arlettae CIL 24, não apresentaram nenhum gene de enterotoxina. A produção e degradação de aminas biogênicas foram quantificadas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa por pareamento de íons. Poucos isolados foram capazes de produzir níveis relevantes de tiramina, histamina, putrescina ou cadaverina, mas um grande número foi capaz de degradar histamina e/ou tiramina. Onze isolados produziram entre 2 e 70 mg.L-1 de uma ou mais das aminas e um isolado produziu 720,35 mg.L-1 de tiramina. Sessenta por cento das 98 estirpes conseguiram degradar histamina e/ou tiramina em diferentes intensidades. Trinta e nove por cento das estirpes que não mostraram atividade de aminoácido descarboxilase sobre tirosina, histidina, ornitina ou lisina, exibiram capacidade de degradar tiramina e histamina, sendo, portanto as mais recomendadas para a composição de consórcios de culturas starter para a fermentação de embutidos cárneos. A relevância deste trabalho consiste na seleção de cocos Gram-positivos oriundos de salames artesanais com características bioquímicas desejáveis para uso na fermentação de embutidos cárneos. A coleção caracterizada possibilita inúmeras combinações de estirpes no desenvolvimento de culturas starter. Estirpes com características desejáveis como boa atividade antagonista, não produção de aminas e bom potencial para degradação de histamina ou tiramina, porém com baixa atividade de catalase e nitrato redutase, podem ser usadas em conjunto com outras estirpes que complementam estas características. Até mesmo estirpes com atividade antagonista, não produção e/ou degradação de aminas e boa atividade de nitrato redutase e catalase, mas que apresentam genes de enterotoxina, podem ser usadas como starters, desde que os respectivos genes de enterotoxina sejam deletados.

Ninety eight strains of Gram-positive bacteria, most of them coagulase- negative staphylococci, originated from Italian type sausages made by artisanal fermentation and industrial fermentation, were characterized in relation to their use as starter cultures. Antagonism to pathogens was evaluated and the possible protein nature of the inhibitory substance was evidenced by reduction of inhibition in presence of protease. Fifty one isolates showed antagonism to Listeria monocytogenes, and 27 of them had their antagonistic action atributed to proteinaceous substance. Thirty seven isolates showed antagonism to Staphylococcus aureus, and 30 of them with antagonistic action related to substance of protein nature. Sixteen strains of staphylococci, from S. capitis subsp. capitis, S. caprae, S. arlettae and S. delphini species exhibited antagonism due to proteinaceous substance against both indicators. All 98 isolates exhibited catalase activity, measured by hydrogen peroxide consumption. Forty six percent of those had high levels of H2O2 degradation, showing values above 28,32 μmoles of degraded H2O2.min-1.mL-1 of cels with OD630nm = 1,0. Sixty eight isolates reduced nitrate in agar with KNO3. Fourty four percent of those had high nitrate reductase activity, showing haloes of nitrate reduction bigger than 12 mm. Eleven isolates originated from artisanal sausages, from S. xylosus, S. arlettae and S. equorum species, presented simultaneously high nitrate reductase and catalase activities, being good candidates as cultures for fermented sausage production. There was a low incidence of genes coding for staphylococcal enterotoxins, detected by PCR, except for the see gene, found in 23,5% of the isolates. Four isolates had both seb and seh genes; two isolates had seh gene; and one isolate had sej gene. The sea, sec and sed genes were not detected in any of the 98 isolates. The see gene was detected in nine of eleven isolates with high nitrate reductase and catalase activities; the others, S. xylosus CIL 28 and S. arlettae CIL 24, had no enterotoxin gene. Biogenic amine production and degradation were quantified by reversed phase ion pair HPLC. Few isolates were found to produce relevant levels of tyramine, histamine, putrescine and cadaverine, and a great number was able to degrade histamine and/or tyramine. Eleven isolates produced values between 2 and 70 mg.L-1 of one or more of the amines and one isolate produced 720,35 mg.L-1 of tyramine. Sixty percent from 98 strains could degrade histamine or tyramine in different degrees. Thirty nine percent of the strains that did not show aminoacid decarboxylase activity on tyrosine, histidine, ornithine or lysine, had the ability to degrade tyramine and histamine. These strains are the most suitable to be used as starter cultures for sausage fermentation. The relevance of this work is the selection of Gram-positive cocci of artisanal origin with biochemical characteristics desired in sausage fermentation. The characterized collection enables a number of combinations between the strains to develop starter cultures. Strains with desired characteristics as good antagonistic ctivity, no production of amines and potential to degrade histamine or tyramine, but low nitrate reductase and catalase activities, can be used together with other strains that complete these characteristics. Even those strains with antagonistic action, which do not produce and/or degrade amines, and have good nitrate reductase and catalase activities, but present enterotoxin genes, can be used as starters if these genes are deleted.