Obtenção de SNPs, reação do feijoeiro comum à ferrugem da soja e piramidação de genes de resistência a Uromyces appendiculatus

Abstract

Este trabalho apresenta resultados de pesquisas desenvolvidas no âmbito do Programa de Melhoramento do Feijoeiro conduzido na Universidade Federal de Viçosa (UFV), sendo este composto por seções ou subprojetos distintos. Desta forma, optou-se por redigi-lo na forma de artigos científicos, sendo um de revisão e quatro de resultados originais, os quais já foram ou serão submetidos para publicação em periódicos internacionais. Por esse motivo, decidiu-se por escrevê-los no idioma inglês, em congruência com as Normas de Redação de Teses e Dissertações da UFV. Os resumos de tais artigos contendo suas justificativas, seus objetivos e principais resultados são apresentados a seguir: 1) Identificação de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) no feijoeiro SNPs, diferenças de um único nucleotídeo ou pequenas inserções/deleções (indels) entre fragmentos homólogos de DNA, foram identificados no feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) por meio do re-sequenciamento de STSs (Sequence-Tagged Sites) gerados por primers desenhados para amplificar sequências shotgun e BAC-end de soja e regiões gênicas e microssatélites de feijão. Os fragmentos de DNA contendo SNPs foram identificados em produtos de PCR (bandas únicas de DNA) obtidos a partir de seis linhagens de feijão, três de origem Andina ( Jalo EEP558 , G19833 e AND 277 ) e três de origem Mesoamericana ( BAT93 , DOR 364 e Rudá ). O tamanho final do alinhamento das sequências de DNA obtidas foi de 134.653 pb, onde foram identificados 677 SNPs, incluindo 555 mudanças de base (295 transições e 260 transversões) e 122 indels. Verificou-se uma frequência de 5,16 SNPs/kb. A diversidade nucleotídica média expressa pelo coeficiente teta de Halushka foi de 0,00226. Este trabalho representa um esforço pioneiro para a identificação de SNPs no feijoeiro. 2) Resistência à ferrugem asiática da soja no feijoeiro A incidência da ferrugem asiática da soja (FAS), incitada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi, tem sido constatada em cultivares de feijão. Neste trabalho, 44 acessos de feijoeiro foram testados para resistência ao P. pachyrhizi. Entre estes estavam incluídas fontes de resistência a diferentes doenças do feijoeiro, cultivares comerciais dos grupos carioca, preto e vermelho, e linhagens avançadas desenvolvidas pelo programa de melhoramento do BIOAGRO/UFV. Foram identificadas 14 fontes de resistência. PI181996 , Pérola e Redlands Pioneer apresentaram os menores graus médios de reação ao patógeno. A herança da resistência à FAS no acesso PI181996 foi estudada e os resultados indicam que esta característica é monogênica e dominante. 3) Melhoramento do feijoeiro para resistência à ferrugem no BIOAGRO/UFV, Brasil O feijoeiro é uma cultura de reconhecida importância social, nutricional e econômica. No entanto, quando comparada a outras espécies leguminosas de interesse agronômico, sua produtividade média ainda é considerada baixa. Um dos fatores que explicam esta situação é o grande número de doenças que acometem o feijoeiro e causam danos severos. Entre elas destaca-se a ferrugem, incitada pelo fungo Uromyces appendiculatus, o qual apresenta alta variabilidade. O controle da ferrugem por meio do uso de cultivares resistentes é uma estratégia viável, econômica e de fácil adoção, a ser usada de forma integrada às outras práticas. Neste trabalho são apresentadas importantes informações sobre a doença, além de relevantes iniciativas de melhoramento visando o desenvolvimento de cultivares resistentes à ferrugem no BIOAGRO/UFV. 4) Caracterização do gene de resistência à ferrugem presente na cultivar de feijoeiro Ouro Negro , a principal fonte de resistência usada no Brasil A identificação e caracterização de novas fontes de resistência (R) constituem etapas fundamentais para os programas de melhoramento que visam ao desenvolvimento de cultivares com resistência efetiva a patógenos. A cultivar Ouro Negro , de origem Mesoamericana, é a principal fonte de resistência à ferrugem utilizada no Brasil. No entanto, seu gene R (Ur-ON) ainda não foi completamente caracterizado em relação a outros já identificados. Neste trabalho, inicialmente, Ouro Negro e linhagens portadoras de genes R já caracterizados foram inoculadas com nove raças de U. appendiculatus. Além disso, o DNA de todas as linhagens de feijão foi analisado com marcadores moleculares ligados a Ur-ON, visando identificar evidências adicionais para a presença de alelos para esse lócus nas fontes R. Finalmente, foi testada a relação alélica entre Ur-ON e os genes de resistência à ferrugem presentes nas linhagens que foram resistentes a pelo menos uma das raças do patógeno. Testes de alelismo entre Ouro Negro e importantes fontes de resistência à ferrugem no Brasil, as quais possuem genes R não caracterizados, foram também realizados. Os resultados indicam que o gene de efeito principal que condiciona resistência ao U. appendiculatus na cultivar Ouro Negro é distinto daqueles com os quais ele foi comparado. 5) Melhoramento do feijoeiro assistido por marcadores moleculares visando à piramidação de genes de resistência à ferrugem A piramidação de genes R assistida por marcadores moleculares foi usada pelo programa de melhoramento do feijoeiro conduzido no BIOAGRO/UFV como uma estratégia para acelerar o desenvolvimento de linhagens com resistência durável e de amplo espectro à ferrugem. Os genes Ur-5 ( Mexico 309 ), Ur-11 ( BelMiDak RR-3 ) e Ur-ON ( Vi-4899 , linhagem do tipo carioca derivada do cruzamento Rudá × Ouro Negro ) foram combinados na cultivar Rudá , a qual possui grãos do tipo carioca. Foram obtidas linhagens apresentando todas as marcas moleculares associadas aos genes R, as quais confirmaram-se resistentes quando inoculadas com raças específicas de U. appendiculatus. Estas linhagens também foram resistentes em avaliações realizadas em condições de campo. Ensaios de rendimento demonstraram que as linhagens obtidas são tão produtivas quanto seu genitor recorrente ( Rudá ) e outras cultivares com grãos do tipo carioca atualmente plantadas no Brasil.

The present work reports results from researches developed at the Common Bean Breeding Program of the Federal University of Viçosa (UFV). It is composed by distinct sectors or sub-projects. We have decided to write it in the format of scientific papers; one of them is a paper review and the other four articles are original reports. They either have been submitted or will be submitted for publication in international refereed journals. For this reason, we have decided to write them in English, according to the Thesis and Dissertations Writing Standards from UFV. Abstracts of these articles containing their justifications, objectives, and main results are presented below: 1) Single nucleotide polymorphisms (SNPs) discovery in the common bean - SNPs were discovered in common bean (Phaseolus vulgaris L.) via resequencing of sequence-tagged sites (STSs) developed by PCR primers designed to soybean shotgun and BAC-end sequences, and to common bean genes and microsatellite flanking regions. DNA fragments harboring SNPs were identified in single amplicons from six contrasting P. vulgaris genotypes of the Andean ('Jalo EEP558', 'G19833', and 'AND277') and Mesoamerican ('BAT 93', 'DOR 364', and 'Rudá') gene pools. In the 131,120 bp of aligned sequence, a total of 677 SNPs were identified, including 555 single-base changes (295 transitions and 260 transversions) and 122 small nucleotide insertions/deletions (indels). The frequency of SNPs was 5.16 SNPs/Kb and the mean nucleotide diversity expressed as Halushka's theta was 0.00226. This work represents one of the pioneer efforts aiming to detect SNPs in P. vulgaris. 2) Resistance to soybean rust in the common bean - Soybean rust (SBR) incited by Phakopsora pachyrhizi has been reported in common bean cultivars. In this work a set of 44 P. vulgaris genotypes were tested for resistance to P. pachyrhizi including resistance sources to several fungal common bean diseases, carioca-type, black-type and red-type Brazilian commercial cultivars, and advanced lines developed by the BIOAGRO/UFV breeding program. Fourteen resistance sources to P. pachyrhizi were identified. 'PI 181996', 'Pérola', and 'Redlands Pioneer' presented the lowest mean scores of disease reaction. The inheritance of SBR resistance in 'PI181996' was studied and the results support the hypothesis that this resistance is monogenic and dominant. 3) Breeding for common bean rust resistance in the BIOAGRO/UFV, Brazil - Common bean is an economically, nutritionally, and socially important crop. Unfortunately, compared to other important grain legumes common bean yields are quite low. One of the several factors contributing to this situation is the high number of destructive diseases that attack P. vulgaris and cause serious damage to the crop. Among them is bean rust, incited by the highly variable fungus Uromyces appendiculatus. Bean rust control by plant resistance isan easy and economical strategy to be used in association to other rust management practices. This review presents an overview about the bean rust and reports some breeding initiatives aiming at the development of rust resistant cultivars in the BIOAGRO/UFV. 4) Characterization of the rust resistance gene present in the common bean cultivar 'Ouro Negro', the main rust resistance source used in Brazil - Identification and characterization of new resistance sources are basic steps for plant breeding programs aiming to develop modern cultivars with effective resistance to pathogens. The Mesoamerican black seeded common bean cultivar 'Ouro Negro' is the main rust resistance (RR) source used in Brazil, but its resistance gene (Ur-ON) has not been fully characterized yet. Here we have compared the RR spectrum presented by Ouro Negro with those of other bean lines harboring known RR genes when inoculated with nine races of U. appendiculatus. In addition, all bean lines were screened with molecular markers linked to Ur-ON aiming to identify additional evidence for the presence of alleles for this locus in the screened RR sources. Finally, we tested the allelic relationships of Ur-ON with already characterized RR genes from lines resistant to at least one race of the pathogen. We also accomplished allelism tests between 'Ouro Negro' and important RR sources in Brazil harboring unnamed RR genes. The results showed that the major dominant gene conditioning RR in 'Ouro Negro' is positioned at a locus distinct from those with which it was compared. 5) DNA marker-assisted breeding aiming rust resistance gene pyramiding in the common bean - In our common bean breeding program we used a gene pyramiding approach assisted by DNA markers aiming to develop bean lines with durable and ample resistance spectrum to rust. The RR genes Ur-5 (from 'Mexico 309'), Ur-11 (from 'BelMiDak RR-3'), and Ur-ON (from 'Vi-4899', a carioca seeded line derived from the cross 'Rudá' × 'Ouro Negro') were combined in the carioca-type bean cultivar 'Rudá'. Carioca seeded beans are the most consumed in the Brazilian market. We were able to select lines presenting all the DNA markers associated to the genes of interest and resistant to all of the specific isolates of U. appendiculatus which were tested. They were also resistant under field conditions. Yield evaluations show that these selected lines are as productive as the recurrent parent 'Rudá' and other high performance cultivars currently grown in Brazil.