Morfogênese in vitro e transformação genética da Alfavaca (Ocimum selloi Benth)

Abstract

Foram estudados alguns fatores que influenciam a organogênese, bem como a regeneração in vitro desta espécie, visando fornecer subsídios à transformação genética. Analisando-se o efeito de concentrações de BAP na indução de multibrotações em segmentos caulinares nodais de O. selloi cultivados in vitro, evidenciou-se que quanto maior a concentração de BAP, tanto menor foi o comprimento dos brotos, porém maior o número de brotos. Menores concentrações de BAP relacionam-se a maiores pesos de matéria seca dos brotos. Estudando-se o efeito de concentrações de sacarose e sais no cultivo in vitro de segmentos caulinares nodais de O. selloi constatou-se que a concentração de 100 % de sais do meio MS combinada com a concentração 2 % de sacarose foi a melhor na propagação in vitro de O. selloi, em razão de se ter obtido brotos mais longos e com raízes grandes, resultando em maior peso do material vegetal. Observando-se o efeito de concentrações de ANA e BAP e da posição dos explantes na indução de organogênese in vitro em segmentos caulinares internodais de O. selloi verificou-se que o primeiro, o segundo e o terceiro segmentos caulinares internodais apresentaram, em meio de cultivo -1 -1 complementado com 1,00 mg L de ANA e 0,25 mg L de BAP, freqüência de calogênese de 60,00%, 50,00% e 60,00%, respectivamente. O primeiro, o segundo e o terceiro segmento caulinar internodal apresentaram, respectivamente, freqüência de organogênese de 93,33%, 73,33% e 73,33%, média de órgãos produzidos de 2,80, 1,80 e 1,80 e eficiência de organogênese de 2,60, 1,32 e 1,32 em meio de cultivo suplementado com 0,10 mg L -1 de ANA e 1,00 mg L -1 de BAP. Verificando-se o efeito de concentrações de ANA na indução do enraizamento em brotos de O. selloi, obtidos a partir de segmentos caulinares internodais cultivados in vitro, evidenciou-se que tanto o número de raízes quanto o comprimento de raízes foram crescentes à medida que elevou-se a concentração de ANA de 0,0 a 1,0 mg L -1 . Avaliando-se o efeito de agentes gelificantes na indução de organogênese em segmentos caulinares internodais de O. selloi cultivados in vitro, averigou-se que o primeiro segmento caulinar internodal comportou-se melhor na indução de brotos comparado ao segundo segmento caulinar internodal e combinado ao Phytagel - “Sigma” foi superior ao associado com Agar - “Merck”. O uso de higromicina com timentin foi mais eficiente que o de canamicina com timentin para a seleção de regenerantes, pois para inibir a organogênese usou-se 10 mg L -1 de higromicina com 300 mg L -1 de timentin e 100 mg L -1 de canamicina com 300 mg L -1 timentin. A freqüência de regeneração de brotos em meio seletivo contendo higromicina e timentin foi de 0,5%, enquanto que a de canamicina e timentin foi de 1,0%. Conclui-se que não foi possível obter plantas transgênicas, pois a transformação genética não foi mostrada pelo teste Gus, nem confirmada por PCR.

Some factors that influence the organogenesis have been studied, as well as the regeneration in vitro of this species, with the aim of providing a basis for genetic transformation. By analysing the effect of BAP concentrations in the induction of multishooting in nodal stem segments of O. selloi cultivated in vitro, it has become clear that the higher the BAP concentration, the shorter the shoots were, though they were in a larger number. A lower concentration of BAP is related to a higher amount of dry matter in the shoots. By studying the effect of sucrose and salt concentrations in the cultivation in vitro of nodal stem segments of O. selloi, it has been observed that the concentration of 100% of salt in a MS medium combined to a concentration of 2% of sucrose was the best one for the in vitro propagation of O. selloi , since the shoots obtained were longer and deeper-rooted, resulting in a larger amount of vegetal matter. By observing the effect of NAA and BAP concentrations and the position of explants in the induction of the organogenesis in vitro of the internodal stem segments of O. selloi, it has been verified that the first, second and third internodal stem segments presented a calogenesis frequency of 60,00 %, 50,00% and 60,00% respectively in a medium of cultivation supplemented with 1,00 mg L -1 and 0,25 mg L -1 of NAA of BAP. The first, the second and the third internodal stem segments presented organogenesis frequency of 93,33%, 73,33% and 73,33%, respectively, an average of organs produced of 2,80, 1,80 and 1,80 and organogenesis efficacy of 2,60, 1,32 and 1,32 in a medium of cultivation supplemented with 0,10 mg L -1 of NAA and 1,00 mg L -1 of BAP. By analysing the effect of NAA concentrations in the induction of rooting in O. selloi shoots, obtained from internodal stem segments cultivated in vitro, it has become clear that both the number of roots and their length grew as the concentration of NAA was increased from 0,0 to 1,0 mg L -1 . By evaluating the effect of gelling agents in the induction of organogenesis in internodal stem segments of O. selloi cultivated in vitro, it has been verified that the first internodal stem segment reacted best in the induction of shoots as compared to the second internodal stem segment, and, combined to Phytagel - “Sigma”, it was better than that associated to Agar - “Merck”. The use of hygromycin combined with timetin was more effective than the use of kanamycin combined with timetin for the selection of the regenerants, since it was used 10 mg L -1 of hygromycin combined to 300 mg L -1 of timetin and 100 mg L -1 of kanamycin combined with 300 mg L -1 of timetin. The frequency of the regeneration of the shoots in a selective medium containing hygromycin and timetin was of 0,5%, whereas that of kanamycin and timetin was of 1,0%. The conclusion was that it is not possible to obtain transgenetic plants, since the genetic transformation has not been shown by the GUS test, neither confirmed by PCR.