Caracterização do gene de SBP2 (Sucrose Binding Protein) de soja em plantas transgênicas de tabaco: análise funcional da proteína e atividade do promotor SBP2

Abstract

Em plantas, a energia luminosa é transformada em energia química na forma de carboidratos, os quais são alocados entre os diferentes tecidos vegetais através do floema. Durante este processo, a sacarose, principal carboidrato transportado em plantas superiores, é “carregada” e “descarregada” no floema com o auxílio de transportadores localizados na membrana plasmática. A proteína SBP (“sucrose binding protein”) foi inicialmente identificada pela sua capacidade em ligar a sacarose e, pelo menos, dois homólogos da proteína, SBP1 e SBP2, têm sido descritos em soja. Neste trabalho, nós analisamos a função de SBP2 em plantas transgênicas de tabaco expressando o cDNA na orientação antisenso e caracterizamos os cis-elementos presentes no promotor que controlam a expressão espacial do gene SBP. Plantas anti- senso na geração T2 apresentaram crescimento e desenvolvimento reduzidos. Este fenótipo, característico de plantas com inibição do transporte de sacarose a longa distância, foi associado a alterações fisiológicas e metabólicas ocorridas, principalmente, na fase vegetativa do desenvolvimento. As plantas apresentaram reduzida fotossíntese e alteração no particionamento de carboidratos, com preferência para o acúmulo de amido nas folhas em detrimento à síntese de sacarose. Nossos dados suportam a hipótese que SBP provavelmente atua no transporte de sacarose a longa distancia no floema, alterando a expressão ou a atividade de proteínas envolvidas em sistemas alternativos de transporte de carboidratos, já que a manipulação dos níveis de SBP também alterou a atividade da invertase e da sintase da sacarose. Consistente com o papel da proteína no transporte de sacarose, um fragmento de 2 kb do promotor de SBP2 dirigiu a expressão do gene repórter de β- glicuronidase (GUS) para as células do floema de folhas, caules e raízes. A caracterização dos cis-elementos presentes no promotor de SBP2 foi realizada por deleções sucessivas na região 5’ e por deleções internas. A deleção da seqüência de - 2000 a -703 causou o acúmulo de GUS em todos os tecidos de folhas, caule e raízes analisados, indicando a presença de cis-elementos que reprimem a atividade do promotor em tecidos, que não o floema, a jusante da posição -703 pb. Deleções sucessivas até a posição -92 indicaram que a atividade tecido-específica do promotor é coordenada pela interação complexa entre elementos negativos e positivos. De fato, elementos negativos fortes foram identificados na seqüência delimitada pelas posições -495 e -370, os quais foram confirmados por experimentos de ganho de função, e também, entre -243 e -193. Foi identificada também uma região silenciadora do meristema radicular na região entre -136 e -92. Uma seqüência curta de 92pb a partir do códon de iniciação de tradução foi capaz de manter altos níveis de expressão basal em todos os tecidos analisados e, portanto, provavelmente representa um promotor eucariótico mínimo em plantas.

The plants are autotrophic organisms with specialized organs that transform the sun light energy in chemical energy as organic compounds, the carbohydrates, which are transported in part to the other organs by phloem. In plants, sucrose is the major transported form of photoassimilated carbon and its translocation involves loading and unloading of the phloem by membrane specific transporters. A sucrose binding protein, SBP, was initially identified by its capacity to bind sucrose and, at least, two SBP homologues, SBP1 and SBP2, have been described in soybean. Here, we analyzed the SBP2 homologue function in tobacco transgenic plants expressing the cDNA in the antisense orientation and characterized the cis-acting elements involved in spatial regulation of the SBP2 promoter. Typical phenotypes of an inhibition of long distance sucrose translocation were observed in the antisense T2 transgenic lines. In general, the growth and development of the transgenic lines was retarded when compared with control plants. This growth-related phenotype was associated with physiological and metabolic alterations during the early plant development. The photosynthetic rate was decreased and the leaf starch content was higher in antisense lines in comparison with control plants. Our data support the hypothesis that SBP may have a regulatory role in phloem sucrose transport by regulating the expression or activity of alternative carbohydrate uptake systems, since the manipulation of the level of the SBP homologue also altered invertase activity and sucrose synthase activity. Consistent with the involvement of SBP in long-distance sucrose transport, the SBP promoter directed the expression of the β-glucuronidase (GUS) reporter gene with high specificity to phloem of leaves, stems and roots of the transgenic tobacco plants. In order to identify potential cis-regulatory elements controlling the spatial expression of SBP promoter, we performed 5’ and internal deletion promoter analyses in transgenic tobacco. The repression of the SBP2 promoter activity in all other tissues of root, stem and leaf is alleviated by deletion of sequences upstream of -703. This indicates that the phloem-specific expression of SBP2 promoter is contributed by tissue-specific silencers in distal sequences as well as phloem-specific elements within proximal sequences of SBP2 promoter. Further deletions of 5’ flanking sequences indicate that SBP2 promoter activity and tissue-specificity is coordinated by negative and positive combinatorial modules that interact to each other in a complex way. Strong negative elements were found in sequences delimited by positions -495 to -370, which were further confirmed by gain-of-function experiments and also between positions -243 and -193. In addition, a root meristem-specific silencer was identified within the region between -136 and -92. A short sequence, spanning from -92 to the start codon, was able to maintain high level of basal expression and may represent a potential eukaryotic minimal promoter.