Cinética de fermentações e estudo de metabólitos e enzimas intracelulares envolvidas na fermentação alcoólica cervejeira conduzidas com leveduras de alta e baixa fermentação em diferentes composições de mosto

Abstract

O objetivo do presente trabalho foi avaliar experimentalmente o crescimento de diferentes tipos de leveduras cervejeiras (Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces uvarum) em diferentes tipos de mosto (substratos), contendo arroz, milho, sorgo, maltose e cana como adjunto do malte em composição. Objetivou-se, assim, ve rificar se tais composições alteram a cinética de fermentação e a atividade de algumas enzimas durante o processo fermentativo em uma temperatura constante. Acompanhou-se também a presença de alguns metabólitos extracelulares (etanol, acetato e glicerol) e glicose, as características físico-químicas e microbiológicas (pH, atenuação, contagem de células, oBrix e densidade) e a qualidade sensorial das cervejas produzidas nas diferentes condições de substratos e leveduras relatadas anteriormente. Durante o preparo dos substratos foram determinados os teores de extrato dos mostos primários e mostos mistos, a massa dos mostos mistos e o rendimento da mosturação. Os processamentos das cervejas foram realizados pelos processos de duas massas e infusão. O mosto foi inoculado com leveduras de alta e baixa fermentação. A fermentação transcorreu a 12°C, sendo encerrada quando 80% do extrato fermentável foi consumido pelas leveduras. Amostras do caldo fermentativo foram coletadas em 0, 12, 24, 36, 60, 84, 108, 132, 156 e 180 horas, no transcorrer da fermentação. Por centrifugação, as células foram separados e posteriormente lisadas com pérolas de vidro e congeladas até o momento de análise. A quantificação enzimática (álcool desidrogenase, piruvato desidrogenase, isocitrato liase, fosfofrutoquinase, glutamato oxaloacetato transaminase e diacetil redutase) e dos metabólitos (etanol, glicerol e acetato) mais a glicose foram realizadas em testes de colorimetria em aparelho Cobas Fara. Na mosturação, o uso dos adjuntos açucarados (cana e xarope de high maltose) apresentou maior teor de mosto primário, maior teor de mosto misto, maior massa de mosto e maior rendimento, que represente a eficiência da mosturação e a taxa de hidrólise do amido em açúcares.Nas análises físico- químicas, o pH foi significativo para as variáveis individuais e não-significativo nas interações. Existiu diferença entre as leveduras na contagem de células, atenuação e extrato aparente. A formação de glicerol e etanol apresentou tendência de aumento ao longo do processo e a produção de acetato foi variável, com bastante oscilações. Constatou-se que o consumo de glicose inicia-se efetivamente após 60 horas. A atividade da álcool desidrogenase apresentou maiores picos de produção em cultivos com a levedura ale, em relação à levedura lager, o que não influenciou os níveis de etanol para as duas leveduras. As melhores atividades da piruvato desidrogenase no cultivo da levedura ale, foi nos substratos maltose, sorgo e cana e para lager nos substratos cana xarope de high maltose e arroz. Os maiores picos de produção da glutamato oxaloacetato transaminase foram detectados na levedura ale em cultivo em caldo de cana, xarope de high maltose e milho e na levedura lager, nos substratos caldo de cana, arroz e milho. A fosfofrutoquinase teve, para as duas leveduras, maiores atividades em cultivos no susbtratos arroz. As maiores atividades da isocitrato liase para levedura ale foi em cultivo nos substratos caldo de cana e sorgo e para levedura lager nos substratos arroz e xarope de high maltose. A maior atividade da diacetil redutase foi no cultivo em substrato sorgo e na levedura lager, no cultivo em substrato arroz. Os adjuntos açucarados apresentaram extratos superiores aos dos amiláceos. Entre os cereais não houve diferença significativa, o complexo amilolítico da levedura agiu igualmente para os três adjuntos. Todos os adjuntos testados são capazes de produzir meios adequados para produção de cerveja. Não há destaque na produção de etanol entre as leveduras, estando na faixa ideal para produção de cerveja. O glicerol não apresenta grandes variações, sendo ligeiramente superior na levedura ale. O acetato, até o final da fermentação (80% de consumo de açúcares), teve tendência de produzir cervejas mais ácidas, mas com possibilidade de diminuição caso a fermentação evoluísse até o final. Os substratos com diferentes constituições químicas influenciaram o comportamento enzimático nas duas leveduras. A atividade da álcool desidrogenase foi baixa, mas não influenciou a produção de etanol. A piruvato desidrogenase apresentou maiores atividades na levedura de alta fermentação, o que caracteriza uma possível maior disponibilidade de intermediário do ciclo de Krebs. Apesar de baixa, houve diferença nas atividades da isocitrato liase entre as duas leveduras, em substratos diferentes, o que deixa claro que maiores atividades em alguns substratos caracteriza a presença de metabólitos oriundos do desvio do ciclo do glioxalato, que pode, em certas situações, determinar uma via glicolítica mais fraca. A atividade da glutamato oxaloacetato transaminase está fortemente relacionada nesses testes com a formação de precursores (aminoácidos) de substâncias essenciais ao sabor da cerveja, em que a atividade apresenta-se mais baixa nas amostras de menor aceitação, com uso de escala hedônica. A atividade da fosfofrutoquinase apresentou-se baixa nas duas leveduras. Essa atividade baixa não influenciou a produção de substâncias como glicerol e etanol, porém picos de produção nos substratos testados indicam atividade glicolítica mais elevada, com potencial de produção de metabólitos- chaves que poderão ser usados em outras vias. A diacetil redutase, apesar de apresentar baixas atividades para as duas leveduras nos substratos, mostra maior potencialidade de redução do diacetil nos substratos sorgo e arroz.

The objective of this work was to experimentally eval uate the growth of different types of brewery yeasts (Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum) in different types of worts (substrates) containing rice, corn, sorghum, maltose, and sugarcane as malt adjuncts in compositions to verify whether such compositions alter fermentation kinetics and the activity of some enzymes during the fermentative process at a constant temperature. The presence of some extra cellular metabolites (ethanol, acetate and glycerol) and glucose, physical- chemical and microbiological characteristics (pH, attenuation, cell count, oBrix and density) as well as the sensorial quality of the beer produced under the different substrate and yeast conditions previously reported, were also monitored. The contents of primary worts and mixed worts, mixed wort mass, and mosturation yield were determined during substrate preparation. Beer processing was carried out by applying the mass and infusion processes. The wort was inoculated with high and low fermentation yeasts. Fermentation occurred at a 12°C, ending when 80% of the fermentable extract was consumed by the yeasts. Samples of the fermentative juice were collected at 0, 12, 24, 36, 60, 84, 108, 132, 156 and 180 hours, throughout fermentation. The cells were separated by centrifugation, and later ruptured with glass pearls and frozen until analysis. Enzymatic quantification (alcohol dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, isocytrate lyase, phophofrutoquinase, glutamate oxaloacetate transaminase and diacetyl redutase) and metabolites (ethanol, glycerol and acetate) plus glucose were carried out in colorimetric tests in Cobas Fara equipment. In mosturation, the use of sugar adjuncts (sugarcane and high maltose syrup) presented higher primary wort content, higher mixed wort content, higher w mass and higher ort yield, representative of mosturation efficiency and starch hydrolysis rate in sugars. In the physicochemical analyses, pH was significant for the individual variables and non-significant in the interactions. There was a difference betwe en the yeasts in cell count, attenuation, and apparent extract. Glycerol and ethanol formation tended to increase along the process and acetate production was variable, with many oscillations. Glucose intake was confirmed to effectively initiate after 60 hours. Alcohol dehydrogenase activity presented higher production peaks in ale yeast cultivations, in relation to lager yeast, which did not influence the ethanol levels for the two yeasts. The best pyruvate dehydrogenase activities in ale yeast cultivation were found in the substrates maltose, sorghum and sugarcane and for lager yeast in the substrates sugarcane, high maltose syrup and rice. The highest glutamate oxaloacetate transaminase production peaks were detected in ale yeast in sugarcane juice, high maltose syrup and corn and in lager yeast in the substrates sugarcane juice, rice, and corn. Phosphofrutoquinase presented greater activities in rice substrate cultivation for both yeasts. The highest isocytrate lyase activities for ale yeast were in the substrates sugarcane juice and sorghum and for the lager yeast, in the substrates rice and high maltose syrup. The greatest diacetyl reductase activity was in sorghum substrate cultivation juice and in lager yeast, in the rice substrate. The sugar substrates presented superior extracts compared to the amylaceous substrates. No significant difference was found among the grains, with yeast amylolytic complex acting equally for the three adjuncts. All adjuncts tested are capable of producing adequate media for beer production. Ethanol production was not outstanding among the yeasts, being within the ideal range for beer production. Glycerol does not present great variations, being slightly superior in the ale yeast. Until the end of fermentation (80% of sugar consumption), acetate tended to produce more acid beer but with the likelihood of decreased acidity if fermentation evolved until the end. The substrates with different chemical constitutions influenced the enzymatic behavior in both yeasts. Alcohol dehydrogenase activity was low but it did not influence ethanol production. Piruvate dehydrogenase presented greater activities in high fermentation yeast, characterizing a possible availability of Krebs cycle intermediates. Although low, there was a difference in the isocytrate lyase activities between the two yeasts, in different substrates, clearly showing that greater activities in some substrates characterized the presence of metabolites originated from the glyoxalate cycle deviation, which can, in some situations, determine a weaker glycolytic pathway. Glutamate oxaloacetate transaminase activity is strongly related in these tests to the formation of precursors (amino acids) of substances essential to beer flavor, in which the activity is lower in less accepted samples, with the use of the hedonic scale. Phosphofrutoquinase activity was low in the two yeasts. This low activity did not influence the production of substances such as glycerol and ethanol, but production peaks in the substrates tested indicate a hi gher glycolytic activity, with potential to produce key-metabolites that can be used in other pathways. Diacetyl reductase, although presenting low activities for the two yeasts in the substrates, shows greater potentiality of reducing diacetyl in the substrates sorghum and rice.