Fibrogênese e adipogênese intramuscular e proteólise post mortem em bovinos Nelore e Angus

Abstract

O presente trabalho foi desenvolvido a partir de dois experimentos descritos em dois capítulos. O primeiro com objetivo de verificar se a adipogênese contribuiria para discrepância no teor de gordura intramuscular presente na carne de animais Nelore comparado a animais Angus em fase de terminação. Objetivou-se ainda investigar se possíveis diferenças na quantidade de células adipo-fibrogênicas presentes no tecido muscular esquelético de animais Angus e Nelore estaria associada à diferença no teor de gordura intramuscular da carne oriunda desses animais. Foram utilizados 6 animais da raça Nelore (peso inicial = 372,5 ± 37,3 kg) e 6 da raça Angus (peso inicial = 382,8 ± 23,9 kg), mantidos sob as mesmas condições experimentais. Os animais foram abatidos no final do período de terminação, e amostras do Longissimus dorsi foram coletadas logo após a sangria, para posterior ánalises de expressão gênica (RT-PCR) e expressão proteica (Western blot). Outras amostras na mesma região muscular foram coletadas 24 horas após o abate, para posterior análise de extrato etéreo e colágeno. Os genes adipogênicos avaliados foram: C/EBPα, PPARγ e Zfp423; Sendo que o PPARγ e Zfp423 também tiveram sua expressão proteica avaliada. Os genes fibrogênicos avaliados foram: COL1A1, COL3A3, FN1, LOX, MMP2, TIMP1, TIMP2, TIMP3 e TGF-β, para o TGF-β também foi realizada expressão de proteína. Além dessas, foram realizadas expressão proteica da SMAD (proteína envolvida na iniciação da fibrogênese) e da PDGFRα (proteína indicadora de células indiferenciadas), comum às vias de sinalização adipogênica e fibrogênica. Não foi observada diferença significativa para expressão gênica dos mRNA adipogênicos e fibrogênicos (P > 0,05). No entanto, houve diferença significativa entre Angus e Nelore para expressão proteica do SMAD (P < 0,05), PPARγ (P < 0,05) e PDGFRα (P < 0,05), em que tais proteínas foram mais expressas nos animais da raça Angus. Embora não tenha sido encontrada diferença para quantificação química de colágeno e sua solubilidade (P > 0,05), houve diferença entre as raças para quantificação química do extrato etéreo, indicando maior deposição de gordura intramuscular em Angus do que em Nelore (P < 0,001). Conclui- se que existe diferença na adipogênese intramuscular entre animais Angus e Nelore, o que contribui para diferenças na quantidade de tecido adiposo intramuscular depositado na carne destes animais. Além disso, a maior expressão de PDGFRα em Angus em relação a Nelore evidencia maior número de células mesenquimais indiferenciadas em músculo esquelético de animais Angus em relação a animais Nelores. Dada à capacidade adipo- fibrogênica das células PDGFRα associado à ausência de diferenças entre as raças quanto à fibrogênese, a maior abundância de células mesenquimais indiferenciadas observada no tecido muscular esquelético dos animais Angus explica a diferença quanto à adipogênese intramuscular entre as raças estudadas. No segundo experimento, objetivou-se avaliar a atividade da calpastatina e expressão de mRNA de possíveis marcadores da maciez da carne no músculo Longíssimus dorsi de Angus e Nelore. Foram utilizados os mesmos animais do experimento anterior. Os animais foram abatidos no final do período de terminação, e amostras do Longissimus dorsi foram coletadas logo após a sangria, para posterior ánalises de expressão gênica (RT-PCR) para calpaína 3 (CAPN3), calpastatina (CAST), caspase 3 (CASP3) e HSP70 (DNAJA1) e também expressão proteica (Western blot) para calpaína e calpastatina. Outras amostras na mesma região muscular foram coletadas 24 horas após o abate, para posterior análise de atividade da calpastatina, força de cisalhamento e índice de fragmentação miofibrilar (IMF). Não houve diferença significativa para expressão gênica da CAPN3, CAST, CASP3 e DNAJA1 (P > 0,05). Apesar da atividade da calpastatina ter sido maior em Nelore do que em Angus (P = 0,0292), não houve diferença para a expressão proteica da calpastatina e nem da calpaína (P > 0,05). No entanto, observou- se diferença significatica para o índice de fragmentação miofibrilar (P = 0,0051), em que a carne de Angus apresentou maior IMF que a do Nelore. Conclui-se que embora haja diferença na atividade da calpastatina entre os dois grupos genéticos estudados, não se é verificado diferença quanto a abundancia dessas proteínas na carne de Nelore e Angus. No entanto, o maior índice de fragmentação miofibrilar dos Angus indica maior degradação miofibrilar post – mortem e consequentemente carne mais macia do que Nelore. A ausência de diferença na expressão da caspase e da HSP70 aqui encontrada, deve ser melhor investigada a fim de esclarecer melhor a importancia destas proteínas no amaciamento da carne de bovinos Nelore e Angus.

This work presents two experiments that were described separately in chapters. The first trial was conducted to evaluate if the difference between Angus and Nellore on intramuscular fat content after finishing period can be explained by adipogenesis. In addition, was evaluated if discrepancy of intramuscular fat content in beef from Nellore and Angus is associated with differences on amount of intramuscular adipo/fibrogenic cells. Six Nellore (initial body weight = 372.5 ± 37.3 kg) and six Angus (initial body weight = 382.8 ± 23.9 kg) were confined at the same experimental conditions. At the end of finishing period, the animals were slaughtered and longissimus muscle samples for quantitative real-time PCR (qPCR) and Western blot were collected just after exsanguination. Longissimus muscle samples for ether extract and collagen assays were obtained at the same carcass region after 24 hours chilling. The qPCR were performed to evaluate mRNA expression of adipogenic genes (C/EBPα, PPARγ and Zfp423) and fibrogenic genes (COL1A1, COL3A3, FN1, LOX, MMP2, TIMP1, TIMP2, TIMP3 and TGF-β). Western blot assays were performed to evaluate protein expression of adipogenic markers (PPARγ and Zfp423), the fibrogenic marker TGF-β and genes related with both pathways (SMAD and PDGFRα). No differences (P > 0.05) were observed for mRNA expression of neither adipogenic nor fibrogenic markers. However, the breed affected (P < 0.05) protein expression of SMAD, PPARγ and PDGFRα, which were greater in Angus than Nellore. Although meat collagen content and solubility did not differ (P > 0.05) among breeds, Angus meat presented greater (P < 0.001) ether extract content than Nellore, proving greater intramuscular fat in Angus beef. In conclusion, the Angus enhanced adipogenesis contribute to greater intramuscular fat content of this breed in contrast to Nellore cattle. In addition, Angus higher PDGFRα expression likely indicate greater muscle content of undifferentiated mesenchymal cells than Nellore. Our data suggest that although PDGFRα cells have adipo/fibrogenic capacity, fibrogenesis is not different among breeds thus greater density of undifferentiated mesenchymal cells in Angus explain the greater adipogenesis compared to Nellore. The second trial aimed to evaluate calpastatin activity and gene expression of meat tenderness markers of longissimus muscle from Angus and Nellore. The same animals from the first trial were used. At the end of finishing period, the animals were slaughtered and longissimus muscle samples for quantitative real-time PCR (qPCR) and Western blot were collected just after exsanguination. The qPCR were performed to evaluate mRNA expression of calpain 3 (CAPN3), calpastatin (CAST), caspase 3 (CASP3) and HSP70 (DNAJA1). Protein expression (Western blot) of calpain and calpastatin were also evaluated. Longissimus muscle samples for calpastatin activity, Warner-Bratzler shear force and myofibrillar fragmentation index (MFI) assays were obtained at the same carcass region after 24 hours chilling period. The mRNA expression of CAPN3, CAST, CASP3 and DNAJA1 genes did not differ (P > 0.05) among breeds. Although Nellore calpastatin activity was greater (P = 0.0292) than Angus, no difference was observed (P > 0.05) among breeds for calpastatin and calpain protein expression. The MFI differ (P = 0.0051) among breeds, which was greater in Angus than Nellore beef. In conclusion, although calpastatin activity is different among breeds the calpastatin and calpain protein abundance are not. Beef from Angus presents greater postmortem myofibril proteolysis and consequently greater tenderness than Nellore beef. Furthermore, the absence of HSP70 and caspase expression differences needs further investigation to better clarify the role of these proteins on meat tenderness.