Functional characterization and regulation of abiotic stress-responsive genes (GmNAC081 and SbMATE) in plants

Abstract

The onset of leaf senescence is a highly regulated developmental change that is controlled by both genetics and the environment. Senescence is triggered by massive transcriptional reprogramming, but functional information about its underlying regulatory mechanisms is limited. In the current investigation, we performed a functional analysis of the soybean (Glycine max) osmotic stress- and endoplasmic reticulum (ER) stress-induced NAC transcription factor GmNAC081 during natural leaf senescence using overexpression studies and reverse genetics. GmNAC081- overexpressing lines displayed accelerated flowering and leaf senescence but otherwise developed normally. The precocious leaf senescence of GmNAC081-overexpressing lines was associated with greater chlorophyll loss, faster photosynthetic decay and higher expression of hydrolytic enzyme- encoding GmNAC081 target genes, including the vacuolar processing enzyme (VPE), an executioner of vacuole-triggered programmed cell death (PCD). Conversely, VIGS-mediated silencing of GmNAC081 delayed leaf senescence and was associated with reductions in chlorophyll loss, lipid peroxidation and the expression of GmNAC081 direct targets. Promoter–reporter studies revealed that the expression pattern of GmNAC081 was associated with senescence in soybean leaves. Our data indicate that GmNAC081 is a positive regulator of age-dependent senescence and may integrate osmotic stress- and ER stress-induced PCD responses with natural leaf senescence thorough the GmNAC081/VPE regulatory circuit. In addition to environmental stressors, many plant species are sensitive to micromolar concentrations of Al. In sorghum, aluminum resistance SbMATE gene is highly expressed at the apex of the radicle and encodes a membrane transporter belonging to MATE family (multidrug and toxic Compound Extrusion family), which is responsible for the efflux activated aluminum citrate. In this species the coding region of the aluminum tolerance gene is identical between tolerant and sensitive cultivars. In a polymorphism is found in the second intron, the MITE type transposable elements were detected in the promoter region, the number of repetitions MITE positively related tolerance. In this work, the analysis in silico showed typical SbMATE promoter sequences of eukaryotic promoters, as well as the presence of cis regulatory elements that confer tolerance in Arabidopsis. The absence of whole promoter activity in transformed Arabidopsis suggesting the presence of negative regulatory cis- elements repressing the activity in Arabidopsis or the presence of transcriptional silencing by RNA interference in Arabidopsis does not occur in sorghum. Deletions promoter showed that the repressors are located in sequence as the transposable element in the absence of this element, the promoter becomes active in every part regardless of the age of plant form. Prospecting for transcription factors that control the responsiveness of SbMATE Sorghum gene and analysis of the interaction between likely transfatores with SbMATE promoter, were performed using mono-hybrid system in yeast and demonstrated the need for obtaining a new cDNA library made for a more appropriate for this plant kit, besides the use of different cloning vectors for analysis of iterations.

O início da senescência foliar é uma mudança do desenvolvimento altamente regulada, que é controlada por ambos genética e ambiente. A senescência é desencadeada por reprogramação massiva de transcrição, mas informações funcionais sobre os seus mecanismos reguladores subjacentes é limitada. No presente estudo, foi realizada uma análise funcional do fator de transcrição de soja (Glycine max) GmNAC081 induzido por estresse osmótico e do retículo endoplasmático (ER), durante senescência foliar natural, utilizando estudos de superexpressão e genética reversa. Linhagens superexpressando GmNAC081- exibiram floração e senescência foliar aceleradas, mas de outra forma se desenvolveram normalmente. A senescência foliar precoce de linhagens superexpressando GmNAC081 foi associada com maior perda de clorofila, deterioração fotossintética mais rápida e maior expressão de genes de codificação de enzimas hidrolíticas alvo de GmNAC081, incluindo a enzima de processamento vacuolar (VPE), uma executora da morte celular programada (PCD) desencadeada no vacúolo. Por outro lado, o silenciamento de GmNAC081 mediado por VIGS adia a senescência foliar e foi associado com reduções na perda de clorofila, a peroxidação lipídica e a expressão de alvos diretos de GmNAC081. Os estudos do promotor-repórter revelaram que o padrão de expressão GmNAC081 foi associado com a senescência, em folhas de soja. Nossos dados indicam que GmNAC081 é um regulador positivo da senescência dependente da idade e pode integrar as respostas de MCP induzida por estresse osmótico, do RE e senescência natural, completando o circuito regulamentar o GmNAC081 / VPE. Além de estressores ambientais, muitas espécies de plantas são sensíveis a concentrações micromolares de Al. Em sorgo, o gene de resistência ao alumínio é SbMATE, altamente expresso no ápice da radícula e codifica um transportador de membrana que pertencem à família MATE (multidrug and toxic compound extrusion family), que é responsável pelo efluxo citrato ativado por alumínio. Nesta espécie a região codificadora do gene de tolerância ao alumínio é identica entre cultivares tolerantes e sensíveis. Além de um polimorfismo encontrado no segundo íntron, elementos transponíveis do tipo MITE foram detectados na região promotora, sendo o número de repetições MITE positivamente relacionada com a tolerância. Neste trabalho, a análise in silico do promotor de SbMATE apresentou sequencias típicas de promotores eucarióticos assim como a presença de elementos cis regulatórios que conferem tolerância ao aluiminio em Arabidopsis. A ausência de atividade de promotores inteiros transformados em Arabidopsis sugerem a presença de elementos cis regulatórios negativos reprimindo a atividade em Arabidopsis ou ainda, a presença de silenciamento transcricional por RNA de interferência em Arabidopsis que não ocorre em Sorghum. Deleções do promotor, mostraram que os repressores estão localizados na sequência do elemento transponível já que na ausência deste elemento, o promotor passa a ser ativo em todas as partes da planta de forma independente da idade. A prospecção por fatores de transcrição que controlam a capacidade de resposta do gene SbMATE de Sorghum e a análise da interação entre prováveis transfatores com o promotor de SbMATE, foram realizadas através do sistema mono-hibrido em leveduras e evidenciaram a necessidade da obtenção de uma nova biblioteca de cDNA confeccionada por um kit mais adequado à esta planta, além da utilização de diferentes vetores de clonagem para as análises das iterações.