Caracterização de um novo vírus de ssDNA infectando fruteiras de clima temperado, e aspectos da interação molecular begomovírus-hospedeiro

Abstract

Fruteiras de clima temperado são de grande importância econômica mundial e são suscetíveis a diversos patógenos transmissíveis por insetos ou nematoides. Seu caráter perene e a propagação vegetativa resultam no aparecimento de diversas doenças complexas, algumas das quais ainda etiologicamente desconhecidas. Em pomares e vinhedos brasileiros frequentemente são observados sintomas de possível origem viral, mas os agentes não foram identificados. Com o objetivo de prospectar agentes virais associados a estas culturas, 74 amostras de fruteiras foram coletadas em diferentes regiões produtoras e avaliadas por PCR e RCA. Um novo vírus altamente divergente, monossegmentado, com genoma de ssDNA circular de aproximadamente 3.400 nucleotídeos, apresentando características moleculares semelhantes às de vírus classificadas nas famílias Circo-, Nano- e Geminiviridae foi detectado em plantas de macieira, pereira e videira. A associação com os hospedeiros foi confirmada e sua infectividade comprovada por meio de inoculação com um clone correspondente ao genoma completo. A análise de sequências e suas características moleculares indicam que este novo vírus poderá pertencer a um novo gênero ou família viral. Os begomovírus (família Geminiviridae) são patógenos de grande importância econômica em diversas culturas, principalmente em regiões tropicais e subtropicais. Eles regulam, direta ou indiretamente, diversos mecanismos de defesa do hospedeiro, a exemplo da via dos pequenos RNAs (smRNAs), de forma a facilitar a infecção viral. O segundo objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de smRNAs em plantas de Nicotiana benthamiana infectadas pelo begomovírus Tomato yellow spot virus (ToYSV). Utilizando sequenciamento de nova geração, bibliotecas de smRNAs de plantas de N. benthamiana, sadias e infectadas com o ToYSV, foram sequenciadas a fim de investigar sua complexidade e compreender os mecanismos regulatórios envolvidos na patogênese. Os resultados indicam que os begomovírus são alvo das vias de silenciamento de RNA (VSR) nas etapas iniciais da infecção e que suas proteínas supressoras de silenciamento atuam in trans para interferir com as VSRs. O sucesso da infecção viral e a indução de sintomas estariam assim, ao menos em parte, correlacionados com a regulação negativa das VSRs, com a mudança do perfil de smRNAs e com a regulação da expressão de diversos genes do hospedeiro que transcrevem mRNAs e miRNAs. A proteína de movimento (MP) dos begomovírus bissegmentados é responsável pelo movimento célula-a-célula, indução de sintomas e na determinação da gama de hospedeiros. O terceiro objetivo deste trabalho foi identificar proteínas de hospedeiros do ToYSV candidatas a interagirem com a MP. Complexos proteicos provenientes de plantas expressando constitutiva- ou transientemente NTAPi-MP foram purificados, seguido de identificação por espectrometria de massas. Entretanto, não foi possível encontrar proteínas que interagissem com MP do ToYSV. Ensaios de pull-down com a proteína MP fusionada a uma etiqueta de seis histidinas (6His-MP) identificaram 64 proteínas da planta candidatas a interagirem com a MP. Destas, 25 foram selecionadas para avaliação da interação pelo sistema duplo-híbrido em levedura, contudo, os resultados foram negativos para todas as 25 proteínas.

Temperate fruit trees are of great economical importance worldwide and are susceptible to several insect or nematode-transmitted pathogens. Their perennial nature and vegetative mode of propagation result in the appearance of several complex diseases, some of which are aetiologically undetermined. In Brazilian orchards and vineyards, virus-like symptoms are often observed, but the causal agents have not been identified. With the objective of prospecting viral agents associated with these plants, 74 fruit tree samples were collected at different regions and evaluated by PCR and RCA. A novel, highly divergent virus with a monopartite circular ssDNA genome of approximately 3400 nucleotides, with molecular characteristics similar to viruses in the Circo-, Nano- and Geminiviridae families was identified in apple, pear tree and grapevine plants. Its association with the hosts was confirmed and its infectivity was proven by inoculation with a full-length genomic clone. Sequence analysis and molecular characteristics indicate that this novel virus will be classified in a new viral genus or family. Begomoviruses (Geminiviridae family) cause diseases of major economic importance in many crops, especially in tropical and subtropical regions. They regulate, directly or indirectly, several host defense mechanisms such as small RNA (smRNA) pathways so as to facilitate viral infection. The second objective of this work was to evaluate the profile of smRNAs in Nicotiana benthamiana plants infected by the begomovirus Tomato yellow spot virus (ToYSV). Using Next Generation Sequencing approaches, we sequenced smRNA libraries from healthy or ToYSV-infected N. benthamiana plants to understand their complexity and to explore the regulatory mechanisms involved in pathogenesis. The results indicate that begomoviruses are targets of RNA silencing pathways (RSP) early in the infection and that their silencing suppressor proteins act in trans to interfere with RSP. The success of viral infection and the appearance of ToYSV-induced symptoms may be correlated, at least in part, with RSP downregulation, smRNA profile change and regulation of expression of several host genes (mRNA- and miRNA-transcribing). The movement protein (MP) of bipartite begomoviruses is responsible for cell-to-cell movement, symptom induction and determination of host range. The third objective of this work was to identify host proteins that interact with the ToYSV MP. Protein complexes were purified from plants expressing NTAPi-MP either constitutively or transiently, followed by mass spectrometry-based identification. However, no candidate host proteins were identified. Pull-down assays using the MP with a six histidine tag (6His-MP) identified 64 candidate proteins, 25 of which were selected for evaluation of the interaction using the yeast two- hybrid system. However, results were negative for all 25 proteins.