Genotipagem de endosperma como estratégia auxiliar no mapeamento e detecção de QTLs em populações exogâmicas

Abstract

No mapeamento genético e detecção de QTLs em populações exogâmicas nem sempre é possível a determinação da fase de ligação dos alelos. Assim, indivíduos heterozigotos são descartados dessas análises por serem não informativos, uma vez que não é possível, por meio do seu genótipo, distinguir a origem de seus alelos em relação aos dois genitores. Dessa forma, o objetivo principal deste trabalho foi propor a genotipagem do endosperma para identificar a origem alélica dos indivíduos heterozigotos. Inicialmente, fragmentos do endosperma representando 10, 25 e 50% do peso das sementes de milho foram retirados, sendo as sementes submetidas ao teste de germinação. Observou-se que a remoção de até 50% do endosperma não afetou a taxa de germinação das sementes. A metodologia de PCR semiquantitativo foi otimizada para diferenciar doses dos alelos nas misturas de DNA foliar de duas linhagens de milho (L3 e L1113-01), representando as diferentes proporções alélicas observadas no tecido endospermático dos seus cruzamentos recíprocos, tendo como base a quantidade máxima de endosperma que podia ser utilizada na extração do DNA. Marcadores SSR foram gerados pela técnica de PCR semiquantitativo, e os fragmentos amplificados foram avaliados tanto em gel de agarose tratado com brometo de etídio quanto em gel de poliacrilamida, usando-se primers fluorescentes. A resolução do gel de agarose não possibilitou a diferenciação das misturas dos DNAs parentais. No entanto, por meio da análise de regressão e da comparação da intensidade da banda correspondente a um mesmo alelo nas diferentes misturas, pôde-se inferir a concentração inicial de cada um dos alelos. A necessidade de um padrão de alelos limitou o uso dessa técnica nas análises de QTLs em populações nas quais pelo menos um dos genitores é conhecido. Já a resolução do gel de poliacrilamida utilizando marcadores fluorescentes foi mais eficiente na genotipagem de endospermas, uma vez que possibilitou a diferenciação da origem materna das sementes dos híbridos recíprocos. Assim, a estratégia de genotipagem do endosperma utilizando primers SSR fluorescentes amplificados pela técnica de PCR semiquantitativo possibilitou a determinação da origem dos alelos dos descendentes heterozigotos derivados de populações exogâmicas, permitindo a inclusão destes na detecção de QTLs e, conseqüentemente, aumentando a precisão das análises.

In the genetic mapping in outbred populations not always it is possible to determine the linkage phase of the alleles. Thus, heterozygous individuals are discarded from these analyses due to the lack of information, once it is not possible, through their genotype, to distinguish the origin of their parental alleles. In this way, the main objective of this work was to propose the endosperm genotyping as a strategy to identify the allelic origin of those heterozygotes individuals. Initially, fragments from the endosperm representing 10, 25 and 50% of the corn seeds weight were extracted and the seeds were submitted to the germination test. The results suggest that the elimination of up to 50% of the endosperm did not affected the seed germination. The methodology of semiquantitative PCR was optimized to differentiate doses of the alleles in the mixtures of DNA derived from leaves of two maize inbred lines (L3 and L1113- 01). It was represented different allelic proportions observed in the endosperm of their reciprocal crosses, based on the maximum amount of endosperm that could be used for DNA extraction. SSR markers were generated by semiquantitative PCR technique and the amplified fragments were evaluated in both agarose gels treated with ethidium bromide and poliacrylamide gels using fluorescently labeled primers. Gel resolution using agarose did not allow the differentiation of the mixtures of parental DNAs. However, through the regression analysis and comparison of the band intensity corresponding to the same allele in the different mixtures, the initial concentration of each one of the alleles could be inferred. The requirement of an allelic pattern limited the use of this technique to QTL analysis in populations where at least one of the genitors is known. Although the resolution of poliacrylamide gels using fluorescent markers was more efficient in the endosperm genotyping, once it was allowed to differentiate the maternal origin of reciprocal hybrids seed´s. So, the strategy of endosperm genotyping using fluorescent SSR primer amplified by semiquantitative PCR allowed the determination of allelic origin in the heterozygous offspring derived from outbred populations, including these individuals in the QTL detection, and consequently, increasing the precision of this analysis.