New insights of Cowpea mild mottle virus (CPMMV) infection in soybean: the involvement of viral replicase in symptoms induction and its interaction with host factors

Abstract

Cowpea mild mottle virus (CPMMV, family Betaflexiviridae and genus Carlavirus) is an emerging virus in Brazil. The virus is transmitted by the whitefly Bemisia tabaci and it infects hosts preferentially of Fabaceae family, being found in different crops in almost all the continents in the world. In this work, several aspects about biology and genetics of CPMMV were dicussed and the CPMMV-host relationship was explored. CPMMV causes varied symptoms in plants in the fields and in greenhouse. The nature of this symptoms variation was determinate in this work using successive inoculations of a CPMMV Brazilian isolate causing necrosis in the CD206 soybean cultivar. Successive inoculations led to the isolate, which previously had caused necrosis to induce mild symptoms (mosaic and vein clearing). This was verified after six successive inoculations of a soybean sample from the field and also from a local lesion of a viral isolate, and thus submitted to a genetic bottleneck, in Nicotiana benthamiana leaves. We have shown that altering of symptoms pattern increased the fitness of the virus and vector, suggesting that the induction of different symptoms by viral variants is an adaptive advantage. The viral region involved in the induction of CPMMV symptoms was viral replicase (encoded by ORF1), different sites distributed throughout the recombinant blocks of ORF1 were associated with phenotype changes. In this work, also shought to the understanding about the replication of CPMMV in soybean identifying factors necessary for replication. To date, all that has been known about betaflexiviruses’s replication is that it occurs in the cytoplasm. None host factor was known. Here, two host proteins able to interact with the RNA-dependent RNA polymerase domain (RdRp) from a yeast two-hybrid vector-constructed soybean cDNA library were indentifyed. For the library construction, soybean plants cv. CD206 with CPMMV infection after 0, 3, 7 and 14 days of inoculation were used. The proteins identified were: the CSC1 type ERD4 (GmERD4) and an inositol methyltransferase (GmIMT). The interaction was confirmed by yeast two-hybrid assays and by Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) assays. Prediction and subcellular localization of both proteins and the RdRp domain were also performed. GmERD4 was located in the endoplasmic reticulum (ER), GmIMT presented cytoplasmic location while the RdRp domain induced punctual structures in the plasma membrane and on the ER network. Analysis of the expression of both genes in soybean plants infected with CPMMV demonstrated that the they were induced after 3 and 7 days of inoculation. Overexpression of GmERD4 and GmIMT was performed on soybean protoplasts infected with CPMMV and it was found that overexpression of GmERD4 increased viral accumulation after 7 days of infection. Viral replicase is involved in different viral infection processes, acting not only on genome replication, but also on the induction of symptoms. This reinforces the multifunctional nature of viral proteins.

O Cowpea mild mottle virus (CPMMV, família Betaflexiviridade e gênero Carlavirus) é um vírus emergente no Brasil. O vírus é transmitido pela mosca-branca Bemisia tabaci e infecta hospedeiros preferencialmente da família Fabaceae, sendo encontrado em diferentes culturas em quase todos os continentes do mundo. Nesse trabalho, vários aspectos da biologia e genética do CPMMV foram discutidos e a relação CPMMV- hospedeiro foi explorada. O CPMMV causa sintomas muito variados em plantas campo e em casa de vegetação. A natureza dessa variação de sintomas foi determinada nesse trabalho utilizando-se inoculações sucessivas de um isolado de CPMMV brasileiro causador de necrose na cultivar de soja CD206. As inoculações sucessivas levaram o isolado que antes causava necrose a induzir sintomas brandos (mosaicos e clareamento de nervuras). Isso foi verificado após seis inoculações sucessivas de uma amostra vegetal de soja proveniente do campo e também a partir do isolado viral oriundo de uma lesão local, e submetido, portanto a um gargalo genético, em folhas de Nicotiana benthamiana. A alteração do padrão de sintomas aumentou adaptabilidade do vírus e vetor, sugerindo que a indução de diferentes sintomas pelos variantes virais é uma vantagem adaptativa. A região viral envolvida na indução de sintomas pelo CPMMV foi a replicase viral (codificada pela ORF1) e diferentes sítios distribuídos ao longo de blocos recombinantes da ORF1 foram associados às alterações do fenótipo. Nesse trabalho, também se buscou compreender um aspectos da replicação do CPMMV em soja, identificando-se fatores necessários à replicação. Até o momento tudo que se sabia sobre a replicação dos betaflexivírus é que ela ocorria no citoplasma. Nenhum fator do hospedeiro era conhecido. Aqui foram identificadas duas proteínas do hospedeiro capazes de interagir com o domínio RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) a partir de uma biblioteca de cDNA de soja construída em vetor de duplo-híbrido de leveduras. Para a construção da biblioteca foram utilizadas plantas de soja cv. CD206 com infecção pelo CPMMV após 0, 3, 7 e 14 dias de inoculação. As proteínas identificadas foram: a ERD4 tipo CSC1 (GmERD4) e uma inositol metiltransferase (GmIMT). A interação foi confirmada por ensaios de duplo-híbrido de leveduras e por ensaios de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC). A predição e a localização subcelular de ambas as proteínas e do domínio RdRp também foram realizados. GmERD4 localizou-se no retículo endoplasmático (RE) e GmIMT apresentou localização citoplasmática, enquanto o domínio RdRp induziu estruturas pontuais na membrana plasmática e sobre a rede do RE. A análise da expressão de ambos os genes em plantas de soja infectadas com o CPMMV, demonstrou que eles foram induzidos após 3 e 7 dias da inoculação. A superexpressão de GmERD4 e GmIMT foi realizada em protoplastos de soja infectados com o CPMMV e foi verificado que a superexpressão de GmERD4 aumentou o acúmulo viral após 7 dias de infecção. A replicase viral está envolvida em diferentes processos da infecção viral, atuando não apenas na replicação dos genomas, mas também na indução de sintomas. Isso reforça a natureza multifuncional das proteínas virais.