Caracterização molecular e de fatores de virulência de Klebsiella sp. isoladas de dietas enterais

Abstract

A identificação morfo-tintorial e bioquímica de 21 isolados de Klebsiella provenientes de amostras de dietas enterais artesanais revelou que 15 deles pertenciam a espécie K. pneumoniae e seis a K. oxytoca. A sorotipagem de K. pneumoniae identificou cinco isolados do sorotipo K5, um do sorotipo K4 e os demais não foram sorotipados pelos antissoros dos grupos K1 a K6. Os resultados das análises por RAPD e da região espaçadora 16S-23S do rDNA mostraram um polimorfismo acentuado entre os isolados de K. pneumoniae e um polimorfismo menor entre os isolados de K. oxytoca. O fragmento de DNA, de 1420 pb, gerado pela amplificação da região 16S do rDNA foi digerido por oito endonucleases de restrição e resultou padrões de RFLP idênticos para todos os isolados. As análises por RAPD e por PCR da região espaçadora do rDNA mostraram-se apropriadas para avaliar a diversidade genética entre estes isolados. A resistência a pelo menos dois antibióticos foi verificada em todos os isolados de Klebsiella e maior prevalência de resistência foi verificada aos antibióticos amoxacilina e ampicilina. Os isolados que apresentaram resistência a um maior número de antibióticos pertenciam a espécie K. pneumoniae provenientes, principalmente, do hospital B. A produção de β-lactamase de espectro ampliado não foi verificada em nenhum dos isolados avaliados. Observou-se que a freqüência de colônias mucóides entre as estirpes foi baixa (23,8%) e que a produção de cápsula foi verificada, microscopicamente, somente nas estirpes, cujas colônias apresentaram aspecto mucóide. K. pneumoniae apresentou maior adesão em células Caco-2 e HEp-2 enquanto K. oxytoca apresentou adesão expressiva apenas em células Caco-2. Porém, a invasão de K. pneumoniae foi constatada nas três linhagens de células eucarióticas, apesar dos índices terem sido baixos em relação aos de adesão. Somente os isolados da espécie K. pneumoniae apresentaram adesão e invasão nas células HEp-2. De uma forma geral, os índices de adesão e invasão foram maiores entre os isolados do hospital A. Nas condições usadas neste estudo, os isolados de Klebsiella não apresentaram atividade hemolítica, de fosfolipase e produção de enterotoxina termoestável, assim como do sideróforo aerobactina. A inoculação intraperitoneal em camundongos sadios e imunodeprimidos com estirpes selecionadas de Klebsiella para a determinação da DL 50 não promoveu a morte dos animais, até uma concentração de 10 7 células por inoculação. Quando camundongos foram alimentados com dietas enterais ou ração não se observou a presença de colônias típicas de Klebsiella na análise de amostras do fígado, baço, coração, rim e pulmão dos animais. Entretanto, em amostras de fígado e pulmão dos camundongos dos grupos que receberam drogas imunodepressoras e, ou antimicrobiana, alimentados ou não com dieta enteral contaminada com 6 x 10 9 UFC/animal de Klebsiella, a presença de colônias típicas foi constatada. Em animais que receberam somente a dieta contaminada, a translocação de Klebsiella também foi observada. A análise do perfil genético, por RAPD, de isolados recuperados desses órgãos revelou similaridades com os padrões de bandas de DNA das estirpes de Klebsiella administradas aos animais, via oral. A presença de Klebsiella no fígado de camundongos que não receberam fonte exógena de Klebsiella, mas que receberam a combinação de medicamentos, sugere que estirpes da microbiota intestinal autóctone foram capazes de translocar quando houve uma depressão do sistema imunológico e uma descontaminação seletiva, promovidas pelo corticóide e antibiótico, respectivamente. A colonização por Klebsiella, proveniente das dietas enterais, no intestino também foi facilitada quando medicamentos imunodepressores e antimicrobianos foram utilizados.

Biochemical testing and microscopic observations of stained cells were used to identify 21 Klebsiella isolates from hospital enteral formulae. Fifteen of the isolates were identified as K. pneumoniae and six as K. oxytoca. Serotyping of K. pneumoniae identified five isolates belonging to serological group K5 and one to serological group K4 while the rest could not be identified using the antisera in serological groups K1 through K6. Results of RAPD analysis and of the 16S-23S rDNA intergenic spacer revealed accentuated polymorphism among the K. pneumoniae isolates and a lesser polymorphism among the K. oxytoca isolates. The 1420 bp DNA fragment generated by amplification of the 16S rDNA region digested with eight restriction endonucleases resulted in identical RFLP patterns for all isolates. RAPD and PCR analyses of the rDNA intergenic spacer were shown to be appropriate tools for evaluating genetic diversity among the isolates. Resistance to at least two antibiotics was observed in all Klebsiella isolates, with greater prevalence of resistance to amoxacillin and ampicillin. K. pneumoniae isolates presented resistance to the greatest number of antibiotics, xiiespecially those isolated from Hospital B. Broad-spectrum β-lactamase production was not observed in any isolate. Presence of mucous was infrequent (6.7%) and capsule production was only observed among the isolates that presented moderate to intense mucous production. Adhesion and invasion were observed in Caco-2 and HEp-2 cells, but not in VERO cells. Only K. pneumoniae isolates adhered to and invaded HEp-2 cells. No hemolysin activity, phospholipase activity, thermostable enterotoxin production or aerobactin siderophore production were observed under the conditions used in this study. Selected Klebsiella isolates were inoculated intraperitoneally in healthy and immunodepressed mice to determine LD 50 but did not prove lethal, demonstrating the avirulence of the isolates. When mice were given enteral formula or animal feed, no typical Klebsiella colonies were observed in liver, spleen, heart, and kidney or lung samples. However, typical colonies were observed in liver and lung samples from animals that received immunodepressant and/or antimicrobial drugs, regardless of whether or not the animals received enteral formula contaminated with 6 x 10 9 CFU Klebsiella per animal. In animals that only received the contaminated formula, translocation was also observed. Genetic profile analysis of isolates retrieved from these organs by RAPD revealed similarities to the DNA band patterns of the Klebsiella strains administered orally to the animals, confirming pathogen translocation. Presence of Klebsiella in livers of mice that did not receive an external source of Klebsiella but that received a combination of medications suggests that autochthonous intestinal microbial strains are able to translocate when the immunological system is depressed as well as a selective decontamination promoted by corticoids and antibiotics, respectively. Intestinal colonization by Klebsiella isolated from enteral formula was also immunodepressant and antimicrobial medications were used.