Caracterização morfológica e bandeamento com laranja de acridina dos cromossomos de pimentão (Capsicum annuum L.)

Abstract

Capsicum é um dos membros economicamente mais importantes de Solanaceae. Das 25 espécies reconhecidas, cinco são extensivamente cultivadas, sendo C. annuum L. a mais importante comercialmente, sobretudo pelo seu valor agronômico como especiaria. Apesar da sua importância econômica, a caracterização citogenética em C. annuum é conflitante na literatura quanto à posição do centrômero, do satélite e da região organizadora do nucléolo (NOR). Essas regiões têm sido reconhecidas citogeneticamente pela presença de constrições secundárias, por métodos convencionais de preparação e coloração; e pelas marcações produzidas pelo bandeamento AgNOR. O presente estudo teve como objetivos desenvolver metodologias para sincronização do ciclo celular de regiões meristemáticas, aplicar técnicas de dissociação celular e secagem ao ar, identificar prováveis pontos de fusão cromossômica e utilizar a metodologia RFA (bandeamento reverso com laranja de acridina) para verificar o seu potencial na identificação de segmentos associados à NOR. As preparações citogenéticas de meristemas radiculares de C. annuum ‘Fortuna Super’, ‘Criollo de Morelos’, ‘Athenas’ e milho foram realizadas pelas técnicas de maceração enzimática, dissociação celular e secagem ao ar. O milho foi utilizado como padrão de NOR, conhecida no cromossomo de número 6. As amostras foram submetidas à coloração convencional Giemsa, enquanto outras, à técnica de RFA. As metáfases foram observadas com objetiva e capturadas diretamente por uma videocâmera acoplada ao microscópio e a um computador. Determinou-se que a concentração e o tempo de exposição apropriados em C. annuum foram de 2 mM de hidroxiuréia por 18 h, enquanto o tratamento com orizalina a 5 μM, durante 3 e 4 h, permitiu o acúmulo de células sincronizadas em prometáfases e metáfases. Em milho, os mesmos pré-tratamentos permitiram o acúmulo de células em prometáfases. Nos três acessos de C. annuum, foi evidenciado um cariótipo- padrão diplóide de 2n=24 cromossomos, sendo 10 pares metacêntricos (1-10), um submetacêntrico com satélite (11) e um acrocêntrico (12). A morfologia desses cromossomos permitiu a diferenciação das constrições primárias e secundárias e a detecção de possíveis pontos de fusão entre cromossomos de C. annuum ‘Fortuna Super’. O bandeamento com laranja de acridina, nos três acessos de C. annuum, revelou uma banda fluorescente verde-amarelada, subterminal no cromossomo 5, e duas bandas mais fortemente marcadas, flanqueando a constrição secundária, no braço curto do cromossomo 11. Já no milho utilizado como padrão de NOR conhecida no cromossomo de número 6 esse bandeamento resultou em bandas flanqueando a constrição secundária desse cromossomo, mostrando a especificidade da técnica nessa região. A técnica RFA aplicada em plantas teve a sua nomenclatura substituída pela Hsc-FA (bandeamento fluorescente da heterocromatina associada à constrição secundária com uso de laranja de acridina).

Capsicum is a Solanaceae member with higher economic importance. From the 25 species that are known, 5 are extensively cultivated, being C. annuum L. the most important commercially, mainly by its agronomic value as spice. Despite its economical importance, the cytogenetic characterization in C. annuum, is still unclear in the literature in relation to centromeric, satellite and nucleolar organized region (NOR) positions. In C. annuum, these regions have been recognized cytogenetically by the presence of secondary constrictions, staining conventional methods and banding AgNOR. In this study, methods of cell cycle synchronization in meristematics regions were developed. It was also used the cell dissociation technique and air dryness and the RFA method (R-bands by fluorescence using acridine orange). Pepper and maize, used as standard, root tips were washed and placed in freshly prepared enzyme solution. Slides were prepared by meristematic celular dissociation, air-dried and placed on a hot-plate (50 °C). Some samples were immediately stained with a Giemsa solution, washed twice in distilled water and air-dried. Others samples were stained by RFA technique of the. Figures of chromosomes were captured with a CCD video camera on an Olympus TM BX 60 fluorescence microscope with a WB filter. The optimal concentration and time of exposure was 2 mM hydroxyurea for during 18 hours. The treatment with 5 μM oryzalina during 3 and 4 hours, resulted in accumulation of synchronized cells in prometaphase and metaphase. In mayze, the same pre-treatment resulted in accumulation in prometaphases cells. In C. annuum ‘Fortuna Super’, ‘Athenas’ and ‘Criollo de Morelos’, was found 2n = 24 chromosomes, being 10 pairs metacentrics (1-10), one pair submetacentric with satellite (11) and one pair acrocentric (12). The chromosomes morphology resulted in the differentiation of primary and secondary constrictions and showed probable chromosome fusions points in C. annuum, ‘Fortuna Super’. Pepper chromosomes showed one weak band emitting yellowish green fluorescence in the secondary constriction of the short arm of chromosome 5 and two more intense bands flanking the secondary constriction in chromosome 11. In the maize line 2-NOR used as a standard, the chromosome 6 showed similar results in the secondary constriction corresponding to the NOR position. In this study, RFA band nomenclature was replaced by Hsc- FA bands (secondary constriction heterochromatin-associated fluorescence using acridine orange).