Caracterização parcial de análogos de genes de resistência em duas espécies de eucalipto

Abstract

A maioria dos genes de resistência (genes R) clonados codifica para proteínas R que contêm um domínio C-terminal rico em repetições do aminoácido leucina (domínio LRR), um domínio central conservado contendo sítios de ligação a nucleotídeos trifosfatados (domínio NBS) e um domínio N-terminal variável (TIR ou não-TIR). O domínio LRR provavelmente está envolvido no reconhecimento de proteínas do patógeno produzidas durante o processo de infecção. O domínio NBS está relacionado com a hidrólise de nucleotídeos trifosfatados e participa de uma sinalização celular necessária à resposta de resistência da planta. A região N-terminal variável pode conter um domínio com similaridade com a proteína ao Toll de Drosophila e Interleucina de mamíferos (TIR) ou ainda um domínio não-TIR, como coiled-coil (CC), ambos aparentemente envolvidos com sinalização celular. Ao contrário do observado em culturas agronômicas, existem poucos trabalhos de caracterização de genes de resistência em árvores, especialmente em Eucalyptus. Estudos de caracterização do transcriptoma desta planta, como parte do projeto Genolyptus (http://genolyptus.ucb.br), resultaram na identificação de várias etiquetas de sequências de genes expressos (ESTs) com similaridade a genes R e genes envolvidos em resposta de defesa. Desta forma, este trabalho teve por objetivos: 1) sequenciar completamente oito cDNAs de eucalyptus pré- selecionados por possuírem similaridade com genes envolvidos em resistência a doenças em diferentes espécies vegetais, como linho e Populus e ao gene Rar1 envolvido em resposta de defesa; 2) identificar clones BACs de E. grandis vcorrespondentes a cada um desses cDNAs, visando a futura determinação desses genes; e 3) sequenciar parcialmente pelo menos um clone BAC visando determinar a estrutura completa de pelo menos um gene similar a gene R. A caracterização dos cDNAs revelou que a maioria dos clones possuem sequências incompletas de genes R. Foram identificados onze clones BACs (insertos variando de 20 a 280 kb) correspondentes a esses genes e um deles foi selecionado (BAC 143 F-12, inserto de 90 kb) para construção de uma biblioteca shotgun, visando a caracterização parcial de seu inserto. As sequências parciais de 917 subclones desta biblioteca foram agrupadas em 14 contíguos sendo que nove apresentaram similaridade com genes conhecidos. Dois contíguos mostraram similaridade com genes que codificam proteínas da classe TIR-NBS-LRR e os demais a genes que codificam para fosfatidilinositol 3-quinases putativas, poligalacturonase e a poliproteínas putativas (retrotransposons do grupo Ty1-copia). Análises mais detalhadas dos contíguos com sequências similares a genes R revelaram que um deles contém a ORF completa de um gene da classe TIR-NBS-LRR e o outro contém um gene truncado com domínios TIR-NBS e parte de um domínio LRR. Esses resultados sugerem que este BAC seja derivado de uma região genômica de E. grandis que contém um agrupamento de genes TIR-NBS-LRR. Futuros estudos de mapeamento genético poderão determinar se a sequência desse BAC co- localiza com genes de resistência em E. grandis.

Several resistance genes (R genes) have been isolated from various plant species in the last decade. These R genes can be categorized into several distinct classes based on their predicted protein structures. The largest class falls into the NBS-LRR class, which encodes a nucleotide site domain and a leucine-rich repeat (LRR) domain. NBS-LRR R genes can be further subdivided into toll and interleukin-1 (TIR) and non-TIR classes based on the presence of a TIR domain at the N-terminus of the protein. In contrast to agronomic cultures, there are few resistance genes characterized in woody plants, especially in Eucalyptus. Transcript characterization studies of this tree, as part of Genolyptus Project (http://genolyptus.ucb.br), have identified several expressed sequence tags (ESTs) similar to R genes and disease resistance response genes. Therefore, this work aimed to: (1) completely sequence eight pre- selected eucalyptus cDNAs with similarity to R genes from flax and Populus and to resistance response Rar1 gene from barley; (2) identify E. grandis BAC clones corresponding to these cDNAs, seeking future R gene genomic organization studies; and (3) partially sequence at least one BAC clone to determine the complete structure of al least one resistance gene analog. The sequencing results showed that the majority of the cDNAs analyzed are truncated, representing incomplete sequences of R genes analogs. Eleven BAC clones were identified (inserts varying from 20 to 280 kb) that correspond to these cDNAs and one (BAC 143F12, 90 kb insert) was characterized by shotgun sequencing. Partial sequences obtained from 917 BAC subclones were viigrouped in 14 contigs. Nine contigs showed similarity to known genes. Two contigs were similar to TIR-NBS-LRR genes and the others to putative phosphatidylinositol 3-kinase, polygalacturonase and putative polyproteins (Ty1-copia group retrotransposons). Detailed analysis of the contigs similar to R genes demonstrated that one has a complete ORF of a TIR-NBS-LRR gene and the other has one TIR-NBS pseudogene with truncated LRR domain. These results suggest that the insert of this BAC is derived from a Eucalyptus grandis genomic region that contains a cluster of TIR-NBS-LRR genes. Future genetic mapping studies will elucidate if these BAC inserts co-localize with known R genes in Eucalyptus.