Toxicidade de cádmio em plantas transgênicas de soja e de tabaco expressando os genes BiP e aldeído desidrogenase

Abstract

A contaminação do solo e da água com metais pesados é um crescente problema ambiental em todo o mundo. Dentre os metais pesados está o cádmio (Cd), que é altamente tóxico para humanos, animais e plantas. A toxicidade desse metal causa estresse oxidativo nas plantas, afetando de maneira negativa seu crescimento e metabolismo, desencadeando alterações bioquímicas, fisiológicas e moleculares que limitam a produtividade das culturas. A expressão de alguns genes confere às plantas maior capacidade de enfrentar os estresses, aumentando sua tolerância a condições adversas do ambiente. Trabalhos desenvolvidos com plantas transgênicas mostraram que a expressão ectópica dos genes BiP e ALDH7 confere tolerância aos estresses hídrico e salino nas plantas. Estas observações levaram à hipótese de que as vantagens adquiridas com a expressão ectópica de BiP e ALDH7 nas plantas poderiam também ser efetivas contra toxicidade por metais pesados. Os objetivos deste trabalho foram estudar a toxicidade de Cd em plantas de soja e de tabaco, avaliando seu efeito no crescimento da planta e caracterizando os sintomas de toxidez; e avaliar se plantas transgênicas de soja superexpressando BiP e plantas transgênicas de tabaco expressando ALDH7 apresentam tolerância ao estresse causado por excesso de Cd. As linhagens de soja transformadas utilizadas neste trabalho foram 35S:BIP-2 e 35S:BIP-4, e para o tratamento controle, foram utilizadas linhagens não-transformadas (“wild type”) (WT). As plantas de soja foram cultivadas durante oito dias em solução nutritiva contendo Cd nas doses 0; 0,5; 1,5; 3,0 mg L -1 . As linhagens de tabaco transformadas utilizadas foram TP55-S3 (senso) e TP55anti-4 (anti-senso), e para o tratamento controle, foram utilizadas linhagens não-transformadas (“wild type”). As plantas de tabaco foram cultivadas durante quatro dias em solução nutritiva contendo Cd nas doses 0; 5,5 e 22,5 mg L -1 . A produção de matéria seca nas plantas das três linhagens de soja estudadas diminuiu com o incremento das doses de Cd na solução nutritiva, no entanto, a linhagem WT apresentou sensibilidade ao Cd significativamente maior do que as linhagens transgênicas, em termos de redução relativa de matéria seca. O teor e o conteúdo de Cd aumentaram tanto na raiz como na parte aérea das plantas das três linhagens de soja, entretanto, as linhagens transgênicas apresentaram maior capacidade de absorver o Cd e transportá-lo para a parte aérea, em comparação com a linhagem WT. Com o incremento das doses de Cd na solução nutritiva, a retenção de Cd aumentou no sistema radicular da soja, nas três linhagens. Os sintomas de toxidez de Cd se caracterizaram pelo aparecimento de manchas avermelhadas nos caules, pecíolos e nervuras das folhas, folhas cloróticas, encarquilhadas, murchas e secas, liberação de exsudados avermelhados nos caules e redução do crescimento. Nas plantas expostas à maior dose de Cd, esses sintomas foram mais brandos nas linhagens transgênicas, superexpressando BiP em comparação às plantas controle. Isso sugere a possibilidade dessas plantas apresentarem mecanismo de tolerância ao Cd. Nas três linhagens de tabaco estudadas, a produção de matéria seca das plantas diminuiu com o incremento das doses de Cd na solução nutritiva, no entanto, a linhagem anti-senso apresentou sensibilidade ao Cd significativamente maior do que as linhagens senso e WT, em termos de redução relativa de matéria seca. O incremento nas doses de Cd na solução nutritiva resultou em aumento do teor de Cd tanto nas raízes como na parte aérea das plantas das três linhagens, apresentando pequena variação entre estas. Houve maior absorção de Cd pelas plantas senso e WT, sendo que essa diminuiu com o aumento das doses de Cd na solução nutritiva. A linhagem anti-senso apresentou menor absorção de Cd devido à maior intensidade de danos no sistema radicular, em consequência da sua maior sensibilidade à toxidez do Cd. Houve maior acúmulo de Cd na parte aérea do que na raiz das três linhagens. As plantas apresentaram danos severos no sistema radicular, murcha acentuada, manchas avermelhadas nas nervuras das folhas, encarquilhamento das folhas novas, clorose internerval e redução do crescimento, sendo esses sintomas mais severos nas plantas anti-senso. Não se observou nenhuma vantagem adquirida com a expressão da proteína ALDH7A nas plantas de tabaco. Entretanto, os resultados sugerem que a expressão do ALDH7A em tabaco pode ser importante para ativar mecanismos de resposta ao estresse oxidativo causado pelo Cd nas plantas uma vez que, mesmo não tendo sido observada tolerância diferencial das plantas senso em relação às plantas WT, a supressão da expressão desse gene nas plantas anti-senso levou a maiores danos causados pelo Cd.

The contamination of the soil and water with heavy metals is one of the biggest problem in the environment in the world. Cadmium (Cd) is a heavy metal highly toxic to humans, animals and plants. Cd toxicity causes oxidative stress in plants, which affects the growing and metabolism in a negative way. Moreover, in Cd contaminated areas, it promotes biochemical and physiological changes, which are associated with lower productivity in the crops around the world. It is known that some genes are able to help the plants to cope with different kind of stresses, in such a way that there is an increase in the plant tolerance to adverse environmental conditions. Transgenic plants, which overexpress BiP and ALDH7 genes, have shown tolerance to hydric and salinity stresses. This kind of occurrence has led to the hypotheses that those genes could confer tolerance to heavy metal toxicity. In this work, the focus was the study of the effects of Cd toxicity in soybean and tobacco in plants expressing BiP and ALDH7, respectively. It was evaluated the plant growth under Cd exposure, it was characterized the symptoms of Cd toxicity in those plants and evaluated if the transgenic lines are more tolerant to Cd stress. In the soybean experimental work, it was used two different transgenic lines of BiP (35S-BiP2 and 35S-BiP4) and a non-transgenic line (wild type) (WT) as a control. Soybean plants were grown in hydroponic conditions in Cd enriched nutrient solutions during eight days, to evaluate the effect of different Cd concentrations 0; 0,5; 1,5; 3,0 mg L -1 in transgenic and non-transgenic plant growth. Dry matter weight decreased in all soybean lines as a result of increased Cd concentration in the nutrient solution. However, the WT line showed higher relative reduction of dry weight compared to the soybean transgenic lines, which suggests a higher sensibility of the WT to Cd toxicity. Cadmium concentrations and contents increased in roots and shoots of soybean as the Cd in nutrient solution was increased and, although the transgenic lines had higher efficiency to transport Cd to the leaves, Cd retention was higher in roots than shoots, for the three lines. Cadmium toxicity symptoms in soybean were characterized by red spots on the stem and petioles, redness in leaf nervures, chlorosis, wrinkled leaves, release of red exudates in the stem and decrease in growth. In plants grown exposed to the highest Cd concentration, these symptoms were less apparent in the transgenic lines plants as compared to the control plants. The results found for the soybean BiP overexpressing lines indicate the possibility that those plants have a mechanism that helps the plant to cope with Cd toxicity and make them more tolerant than the WT plants. The experiment with tobacco was performed with plants that express the ALDH7 in sense orientation (TP55-S3) and antisense orientation (TP55anti- 4) and non-transgenic plants (wild type) as control. The tobacco plants were grown in nutrient solutions that received Cd at the concentrations 0; 5.5 e 22.5 mg L -1 , by four days. The three tobacco lines showed a decrease in dry weight production when Cd concentration was raised in nutrient solution. The line TP55anti-4 presented a higher sensibility to Cd compared to WT and TP55-S3 lines, when the data of relative decrease in dry matter yield were compared. Cadmium concentrations in roots and shoots increased as a result of the raise in the Cd concentrations in the nutrient solutions, for the three lines, with low variation among them. Cadmium absorption was higher in WT and TP55-S3 plants and decreased when the solution Cd concentration was raised. The lower Cd absorption in TP55anti-4 was due to more severe damage that occurred in its root system, which is related to the higher sensibility of those plants to Cd toxicity. Cadmium accumulation was higher in shoots than in roots for the three tobacco lines. It was observed severe damage in the root system, along with loss of cell turgor, red spots in the leaves nervures, wrinkled leaves, chlorophyll loss and decrease in growth. All these symptoms were more severe in the TP55anti-4 line. Even though no acquired advantage had been observed in the tobacco plants expressing ALDH7A as compared to the WT plants, the results indicate that the expression of the ALDH7A in tobacco may be important to activate a tolerance mechanism to cope the oxidative stress caused by Cd. This is based on the observation that although no differential tolerance had been observed for the sense plants as compared to the WT plants, the suppression of this gene in the TP55anti-4 plants has led to more severe damage caused by Cd toxicity in those plants.